CFH基因多態性與玻璃體液VEGF對年齡相關性黃斑變性患者抗VEGF療效影響的交互作用△

趙 文 趙 斐 李 敏 葉慧芳

年齡相關性黃斑變性(AMD)是繼青光眼、白內障后眼科常見的第三大類致盲性疾病，慢性進行性是AMD病情進展的重要特點，因此，及時有效治療意義重大[1]。雷珠單抗能通過抗血管內皮生長因子(VEGF)機制，防治AMD造成的視力損害，但并非所有AMD患者均能視力獲益，加之玻璃體內注射雷珠單抗為侵入性，且費用昂貴，存在眼內炎、外傷性白內障等并發癥風險，故掌握AMD抗VEGF治療無應答機制，明確其危險因素，對精準篩查抗VEGF治療適宜人群至關重要[2]。補體因子H(CFH)基因定位于染色體1q32上，當前已證實CFH基因多態性與AMD易感性相關，是AMD的一個重要遺傳學機制，但是否會影響抗VEGF應答性尚未完全明確[3]。黃斑區脈絡膜新生血管是AMD主要病理特征之一，VEGF具有促血管新生作用，參與AMD發病與病情進展[4]?；诖?，本研究嘗試探討CFH基因多態性與玻璃體液VEGF對AMD抗VEGF療效影響的交互作用，期待為抗VEGF治療應答結果異質性的闡明、合理使用抗VEGF藥物等提供數據支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年5月～2022年1月廣州醫科大學附屬第三醫院眼科149例(149眼)AMD患者為研究對象。納入標準：(1)符合AMD診斷標準[5]，AMD分型為濕性；(2)既往無相關治療史；(3)單側發??；(4)自愿簽署知情同意書。排除標準：(1)既往有眼部手術史者；(2)青光眼、葡萄膜炎；(3)視網膜脫離；(4)高度近視、遺傳性疾病等其他原因造成的黃斑區脈絡膜新生血管；(5)出現瘢痕化的AMD患者；(6)嚴重的心腦血管疾病者。全組患者均自愿簽署知情同意書，本研究獲本院倫理委員會批準同意。

1.2 方法

1.2.1 治療方法與分組所有患者均給予雷珠單抗(Novartis Pharma Schweiz AG，批準文號S20181010)0.5 mg玻璃體內注射，治療周期為3個月，之后根據病情需要進行注射。所有患者均完成3次注射。根據抗VEGF治療是否有應答，分為應答組(111例111眼)、無應答組(38例38眼)。應答組：治療后3個月，視力提高≥5個ETDRS字母數；無應答組：視力改善<5個ETDRS字母數。無應答組患者年齡、體重指數、性別比例、眼別、視網膜積液、橢圓體帶完整性、眼壓、最佳矯正視力與應答組比較，差異均無統計學意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2.2 主要試劑與儀器PCR儀(75002型，美國ABI公司)；分光光度計(AA-200型，美國PE公司)；DNA提取試劑盒(山東博科生物)；PCR反應試劑盒(美國Axygen公司)；酶標儀(國產彩虹GF-M3000型)；VEGF試劑盒(上海初態生物)。

1.2.3 檢測CFH基因多態性檢測方法：就診時采集5 mL肝素抗凝空腹靜脈血，DNA提取試劑盒提取DNA，分光光度計檢測純度，通過Sanger雙脫氧終止測序法檢測CFH位點rs800292、rs1061170、rs529825、rs1410996位點的基因型，以基因DNA為模板，進行PCR擴增，反應體系包括Taq DNA聚合酶、引物、4種dNTP、靶序列DNA和PCR反應緩沖液。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃低溫復性30 s，72 ℃退火延伸1 min，擴增40個循環。

1.2.4 檢測玻璃體液VEGF三通道玻璃體切割法采集玻璃體液標本0.5 mL，將玻璃體切割頭切割端斷開，此斷開口通過一個針頭連接一無菌帶蓋密封的玻璃瓶，另一個針頭通過無菌蓋連接原玻璃體切割導管斷開位置，接機器端，此時即可按常規方法切割玻璃體，可控地收集玻璃體液。采集后患者若有眼部出血，需根據出血量多少酌情處理，出血量較少時，保守治療，避免劇烈運動，半臥位休息，出血量較多時，給予促進出血吸收的藥物。所有患者術中與術后均無并發癥發生。應用酶標儀和雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測玻璃體液VEGF水平，讀取450 nm波長下的光密度值，繪制標準曲線，查出對應VEGF濃度。

1.3 觀察指標(1)比較兩組患者CFH位點rs800292、rs1061170、rs529825、rs1410996位點基因型分布；(2)比較兩組患者玻璃體液VEGF水平；(3)比較玻璃體液VEGF不同水平患者CFH基因多態性；(4)分析抗VEGF療效的影響因素；(5)分析CFH基因多態性與玻璃體液VEGF對抗VEGF療效影響的交互作用。

2 結果

2.1 兩組患者CFH基因多態性比較無應答組患者CFH位點rs800292、rs529825、rs1410996各基因型分布與應答組比較，差異均無統計學意義(均為P>0.05)；無應答組患者CFH位點rs1061170基因型分布與應答組比較，差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組患者CFH基因多態性比較

2.2 兩組患者玻璃體液VEGF比較全部患者玻璃體液VEGF為(632.37±189.03)×10-9g·L-1，根據VEGF水平分組，VEGF高水平患者42例，低水平患者107例。無應答組患者玻璃體液VEGF為(843.26±151.85)×10-9g·L-1，高于應答組(560.17±129.34)×10-9g·L-1，(t=11.128，P=0.000)。

2.3 玻璃體液VEGF不同水平患者CFH基因多態性比較玻璃體液VEGF高水平患者與低水平患者CFH位點rs800292、rs529825、rs1410996各基因型分布比較，差異均無統計學意義(均為P>0.05)；玻璃體液VEGF高水平患者CFH位點rs1061170基因型分布與低水平患者比較，差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 玻璃體液VEGF不同水平患者CFH基因多態性比較

2.4 抗VEGF療效的影響因素分析以抗VEGF治療是否有應答為因變量(有=0，無=1)進行單因素和多因素Logistic回歸分析，結果顯示，在全部AMD患者中，玻璃體液VEGF、CFH位點rs1061170 CC基因型均是抗VEGF療效的獨立相關影響因素(均為P<0.05)；CFH位點rs1061170 TC基因型與抗VEGF療效無關(P>0.05)(表4)。

表4 抗VEGF療效的影響因素分析

2.5 CFH基因多態性與患者玻璃體液VEGF對抗VEGF療效影響的交互作用分析在全部AMD患者中，單獨玻璃體液VEGF的OR值為41.250，單獨rs1061170基因型CC的OR值為22.000，兩者共存時的OR值為759.000，且γ為1.068，提示患者玻璃體液VEGF升高與CFH位點rs1061170 CC基因型在抗VEGF療效中呈正向交互作用；同時交互作用<兩單獨因素OR值的乘積，則患者玻璃體液VEGF升高與CFH位點rs1061170 CC基因型交互作用符合次相乘模型(表5)。

表5 CFH基因多態性與患者玻璃體液VEGF對抗VEGF療效影響的交互作用分析

3 討論

抗VEGF已成為現階段AMD的一線治療藥物，多項隨機臨床試驗亦證實抗VEGF治療的有效性、可靠性，但仍存在部分患者在接受昂貴治療后獲益較小或無獲益，表現出對抗VEGF治療無應答，所以有必要對此進行深入研究[6]。

先天免疫系統中，補體系統能通過凝集素、旁路、經典途徑矯正自身組織、防御入侵病原體，其中涉及多個相互關聯的分子級聯途徑[7]。補體C3作為補體系統中含量最多、最重要的成分，是凝集素和經典途徑的匯合點，也是旁路途徑激活的關鍵因子，在補體激活途徑中處于樞紐位置[8]。C3可在C3轉化酶作用下，分解為C3a、C3b，其中C3a能結合自身受體刺激膠原蛋白在黃斑區視網膜色素上皮的沉積，在AMD發病早期起到重要作用；C3b過度沉積可激活補體旁路途徑，造成AMD病情進一步進展[9-10]。CFH一方面能抑制C3轉化酶形成，加速C3轉化酶衰變，另一方面CFH對C3b具有較高親和力，可競爭性結合C3b，促進C3b的裂解，保護宿主細胞免受攻擊和損傷，從而防止C3a、C3b介導的AMD及其病情的進展[11-12]。

本研究結果表明，無應答組患者CFH位點rs800292、rs529825、rs1410996各基因型分布與應答組相似(均為P>0.05)，無應答組患者CFH位點rs1061170基因型分布與應答組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，提示CFH位點rs800292、rs529825、rs1410996與AMD抗VEGF治療應答無關，CFH位點rs1061170可能與AMD抗VEGF應答有關。為了揭示兩者關系，本研究進一步進行了Logistic回歸分析，結果表明，CFH位點rs1061170 CC基因型是抗VEGF療效的獨立相關影響因素。Blánquez-Martínez等[13]報道納入了高度近視伴脈絡膜新生血管患者，發現CFH位點rs1061170 TT基因型患者較CC基因型患者有更好的治療效果。Medina等[14]對AMD患者注射抗VEGF藥物后，發現CC基因型患者治療后最佳矯正視力低于TT+TC基因型，與本研究結論相似。CFH位點rs1061170多態性位于第9外顯子的1277位置上，T堿基突變為C可使CFH第402位酪氨酸變為組胺酸，減弱旁路途徑活性，降低對C3a、C3b的轉化作用，造成補體系統過度激活、脈絡膜血管內皮損傷，以及新生血管持續形成，故會影響抗VEGF治療反應性[15-16]。

VEGF可作用于視網膜，使視網膜長出新生血管[17]。有研究[18]發現，AMD患者外周循環中VEGF高于健康人群，且其表達水平與患者視力喪失密切相關。盡管目前關于AMD患者VEGF表達水平的研究較多，但致力于研究VEGF與治療應答性關系的報道較少。本研究結果表明，與應答組比較，無應答組患者玻璃體液VEGF升高，是AMD抗VEGF療效的獨立影響因素。VEGF不僅能促進血管內皮細胞分裂、增殖，還能增加血管壁通透性[19]。高水平VEGF可介導大量新生血管，增加治療難度，并能通過調節血管壁通透性，引起黃斑區炎癥反應，損傷血管內皮細胞，形成惡性循環，從而影響抗VEGF療效[20]。本研究結果表明，患者玻璃體液VEGF升高與CFH位點rs1061170 CC基因型在抗VEGF療效中呈正向交互作用，且交互作用符合次相乘模型，提示CFH基因多態性與玻璃體液VEGF共存時，可進一步降低患者對抗VEGF治療的應答。對VEGF高水平患者，或可通過增加抗VEGF藥物劑量、次數等保證療效，但對CFH位點rs1061170 CC基因型患者，經抗VEGF治療后獲益的可能性較小，尤其是當患者玻璃體液VEGF水平較高時，應酌情考慮選取其他治療方法，以保證治療方案的有效性，并減少盲目應用抗VEGF藥物增加患者經濟負擔及潛在的并發癥風險。另外，本研究因診斷需要，在患者充分知情前提下，采集眼局部玻璃體液VEGF，雖然保證能可靠地反映患者新生血管的生成潛能與病情進展可能性，但為侵入性操作，其臨床推廣應用情況受到患者接受度的影響，這是本研究一個局限之處，下一步需改進標本采集方法，以增加其臨床大范圍應用的可能性。

綜上所述，患者玻璃體液VEGF升高與CFH位點rs1061170 CC基因型在AMD抗VEGF療效中呈正向交互作用，且交互作用符合次相乘模型，這能為臨床抗VEGF藥物精準使用提供參考，一方面能保證治療方案的有效性，另一方面能減少盲目應用抗VEGF藥物增加患者經濟負擔及潛在的并發癥風險。