靶向調節腫瘤微環境治療乳腺癌的研究進展 ①

牛振宇，田 晶

(桂林醫學院，廣西 桂林 541199)

根據GLOBOCAN2020數據預測，2020年全球乳腺癌新發病例約230萬人，占癌癥新發病例數總和的11.7%，已超過肺癌位居全球癌癥發病率第一位[1]。在中國，乳腺癌發病率也呈逐年上升趨勢，預計2020年乳腺癌發病率可達41.6萬人，同樣成為中國女性發病率第一的惡性腫瘤[2]。雖然早發現早治療可大大提高乳腺癌患者的生存率，但隨著時間的推移，人們發現常規綜合治療手段的發展遇到了瓶頸，難以進一步降低術后患者乳腺腫瘤的轉移率和復發率，且不良反應明顯。因此，尋找新的乳腺癌發生機制以新的生物學靶點變得尤為重要。

腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)是指正常細胞在向惡性細胞轉化過程中與細胞一起產生變化并為其提供相應支持的微生態系統，即腫瘤或腫瘤干細胞生存的內環境。作為腫瘤細胞賴以生存的重要場所，TME成分十分復雜，包括多種類型的細胞(免疫細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞等)、細胞外基質及大量活性分子(細胞因子、激素、生長因子等)。有研究結果表明，TME中的細胞成分與腫瘤的發生、發展以及轉移密切相關，所以靶向TME為腫瘤治療提供了新的思路和新的研究方向[3]。本文綜述了TME在乳腺癌細胞生長、轉移和產生耐藥性方面的作用與分子機制，以及靶向腫瘤微環境進行抗乳腺腫瘤治療的最近研究進展。

1 乳腺癌微環境中內皮細胞

在腫瘤微環境的長期刺激下，正常血管內皮細胞的形態、表型、功能甚至基因表達均會發生異常改變，最終轉化成為腫瘤內皮細胞(tumor endothelial cells， TECs)。不同于正常內皮細胞，TECs管壁上有著大量的通道和孔洞，因而具有高通透性，同時細胞間存在基底膜不完全或缺失的情況，這些特點均利于腫瘤細胞穿透血管壁從而完成遠處轉移。此外，內皮細胞中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體-1和VEGF受體-2表達水平較正常內皮細胞上調，因此對于VEGF的敏感性也更強，處于一種高增殖、高轉移的活化狀態。所以TECs能夠促進腫瘤新生血管的形成，進而影響癌細胞的生長和轉移。最新研究發現，腫瘤內皮細胞還可釋放多種血管內皮衍生因子(統稱為angiocrine)，調控血管生成和腫瘤生長。Ghiabi等[4]報道，TECs在與乳腺癌細胞接觸后，Jag1配體過表達，從而激活notch信號通路，形成一個促進癌細胞生長和轉移的壁龕。Lee等[5]則證明，血管內皮細胞與腫瘤細胞相互作用后，可使癌細胞獲得干細胞樣特性并促進其發生上皮間質轉化。

2 乳腺癌微環境中免疫細胞

隨著對腫瘤發生發展與免疫系統相關性的深入了解，人們逐步認識到免疫細胞在發揮免疫功能的同時，其所參與形成的炎性腫瘤微環境反而對腫瘤進程有著促進作用。因此，炎癥微環境被認為是腫瘤的十大基本特征之一。目前已知的參與腫瘤微環境的炎癥細胞主要包括巨噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞等。

2.1 腫瘤相關巨噬細胞

腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)，分為M1和M2兩種類型。機體主要通過巨噬細胞M1型和M2型間的平衡維持機體平衡和調控炎癥反應[6]。在乳腺癌微環境中，非極化巨噬細胞在2型T輔助細胞(Th2細胞)因子的刺激下，可轉化成具有獨特表型的腫瘤相關巨噬細胞，為腫瘤微環境中數量最多的免疫細胞。大量臨床分析表明，原發性乳腺癌中腫瘤相關巨噬細胞的浸潤程度與患者預后密切相關，高TAM浸潤可顯著增加患者淋巴轉移風險、縮短生存期。環氧合酶-2(cyclooxygenase-2， COX-2)作為花生四烯酸代謝的重要限速酶，正常情況下體內僅表達微量，但在腫瘤組織中被發現高表達于巨噬細胞、內皮細胞等，且高表達COX-2的TAMs細胞數量與乳腺癌淋巴結轉移情況密切相關[7]。上調TAMs中COX-2的表達，可激活下游Akt信號通路，促進乳腺癌細胞增殖，抑制細胞凋亡，提高腫瘤細胞的上皮間質轉化和轉移能力。與此相應，COX-2特異性抑制劑依托昔布能夠有效抑制TAMs分化，使其喪失M2巨噬細胞特性，M2型TAMs表達趨化因子CCL17、CCL18、CCL22和CCL24能增加VEGF、IL-8、MMP、轉化生長因子。同時，下調細胞內多個腫瘤轉移相關因子的表達，如VEGF-A、VEFG-C和MMP-9，減少BALB/c小鼠乳腺癌模型的肺轉移[8]。此外，TAMs可通過分泌CCL2激活乳腺癌細胞中PI3K/Akt/mTOR 信號通路，增加乳腺癌的耐藥性，降低癌細胞對于他莫西芬的敏感性，同時刺激巨噬細胞的募集。與此相反，耐藥的乳腺癌細胞所分泌的TNF-α會激活TAMs中 mTORC1-FOXK1信號途徑，促使其向M2表型極化，從而分泌更多的CCL2，最終在TAMs與乳腺癌細胞中形成正反饋環路[9]。在腫瘤微環境中，TAMs主要向M2型巨噬細胞極化促使腫瘤向惡性腫瘤進展[10]。相關研究結果還表明，腫瘤相關巨噬細胞分泌的多種因子，如TNF-α、IL-6等，通過調控癌細胞中EGFR/PI3K/Akt、NF-κB/STAT3/ERK等途徑，也可引起乳腺腫瘤的耐藥性[11]。

2.2 腫瘤相關肥大細胞

研究發現，肥大細胞的特異性標志物類胰蛋白酶在乳腺癌患者血清中的濃度較正常人增加4倍以上，提示乳腺腫瘤中存在大量肥大細胞浸潤。Samoszuk和Marech等則證實，乳腺腫瘤組織中類胰蛋白酶水平和浸潤的肥大細胞數量均與微血管密度呈顯著正相關[12-13]。此外，與非轉移性乳腺癌相比，類胰蛋白酶陽性的肥大細胞比例在轉移性乳腺癌患者淋巴結中明顯增高，提示肥大細胞可能與淋巴侵襲轉移有很高的相關性[14]。進一步研究發現，肥大細胞所分泌的類胰蛋白酶可與血管內皮細胞上蛋白酶激活受體-2(proteinase activated receptor-2，PAR-2)結合，促進內皮細胞的增殖。類胰蛋白酶還可促進乳腺癌細胞中MMP-2、TIMP-2的表達，增強其侵襲轉移能力。另一方面，不同來源的臨床數據分析顯示，乳腺腫瘤中的肥大細胞浸潤具有保護作用。腫瘤基質中肥大細胞的存在對于乳腺癌患者預后有積極影響，特別對于未發生淋巴結轉移的患者，肥大細胞浸潤程度與生存率呈強相關性[15]。Naik等[16]也觀察到，腋窩淋巴結中肥大細胞數量越多，患者預后越好，并且與肥大細胞在淋巴結中分布模式差異無關。因此，有部分學者認為，肥大細胞浸潤可作為一個獨立的良好乳腺癌預后標志?？梢?，有關肥大細胞浸潤對乳腺腫瘤發展過程的影響仍然存在很大爭議，需要進一步研究來闡明肥大細胞的確切作用。

2.3 腫瘤浸潤淋巴細胞

腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TILs)的作用機制主要有直接殺傷作用、死亡受體介導的細胞凋亡、分泌炎性細胞因子介導的細胞溶解與凋亡[17]。Lotfinejad 等[18]對共計1152名乳腺癌患者進行Meta分析后發現，腫瘤浸潤淋巴細胞與三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)臨床病理特征(腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移)不相關，但高水平TILs患者治療后無病生存期和總生存期會明顯延長。Denkert等[19]研究發現，在人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)過表達型乳腺癌患者中，高水平TILs患者接受新輔助化療后無病生存時間也會相應延長，可總生存期不會發生明顯改變。而大量關于TNBC患者的臨床數據分析中發現，淋巴細胞在早期患者腫瘤基質中浸潤密度的升高可明顯降低患者復發風險和死亡風險，提高完全病理緩解率。但是，TILs在Luminal型乳腺癌細胞中的作用目前尚不明確。Gao與Waks的研究結果相似，高水平TILs在Luminal/HER2-乳腺癌亞型中與完全病理緩解率和患者生存率不相關，不可作為預后評估及療效預測指標[13，20]。一些研究結果表明，高水平TILs與Luminal型乳腺癌接受芳香化酶抑制劑治療效果差有關，同時此類患者在接受新輔助化療效果會更差。Ohno 等[21]報告高水平TILs的Luminal/HER2-乳腺癌患者經過輔助化療后，總體生存率要高于低水平TILs患者，預后較好。由此可以看出，在不同分子分型的乳腺癌中，TILs 的療效預測及預后評估的臨床價值存在差異，不能一概而論。

3 乳腺癌微環境中成纖維細胞

腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，TAFs)是腫瘤微環境中最主要的基質細胞，一方面其產生的ATP和代謝中間體可被鄰近的癌細胞所攝取后直接供能或轉化重新用于ATP合成；另一方面通過分泌生長因子、細胞因子以及趨化因子等對腫瘤細胞和腫瘤微環境進行調控[22]。腫瘤相關成纖維細胞通過直接作用或旁分泌的方式影響免疫細胞功能或減少免疫細胞與癌細胞的物理接觸，以降低機體免疫系統對癌細胞的識別和殺傷，這是促進腫瘤免疫逃逸的重要環節[23]。目前為止，CAFs被證明分泌的生長因子包括成纖維表皮生長因子、血管內皮生長因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子和基質細胞衍生因子1等。在乳腺腫瘤組織中，Tyan等[24]最先明確了癌細胞可經細胞旁途徑刺激成纖維細胞中肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的分泌，從而促進癌細胞本身的生長和轉移。Suh等[25]則通過體內外實驗證明，CAFs通過旁分泌成纖維表皮生長因子2(fibroblast growth factor-2，FGF2)作用于雌激素受體陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231上FGF受體1(FGFR1)，促進癌細胞的增殖、遷移與侵襲。此外，腫瘤相關成纖維細胞所分泌的細胞因子和趨化因子TNFα和IL1β被證明可以開啟基質細胞與TNBC細胞向侵襲性惡性表型的轉化，上調CXCL8/IL8、CCL2和CCL5的表達，促進癌細胞的侵襲和轉移能力。腫瘤轉移過程中的一個關鍵步驟是癌細胞的上皮間充質化，而CAFs被證實可以分泌IL3、EGF等因子，激活下游p38MAPK、Wnt通路，誘導乳腺癌細胞間充質樣改變、干細胞化以及侵襲。同時，腫瘤相關成纖維細胞還參與了腫瘤微環境構建。Raz等[26]研究表明，骨髓來源的基質細胞(BM-MSCs)是CAFs的前體細胞之一，其分化形成的成纖維細胞在乳腺癌原發灶和肺轉移灶中均大量存在，并且能夠引起特定的炎癥反應，促進血管生成與轉移前微環境的形成，從而支持肺轉移。

4 靶向乳腺腫瘤微環境的臨床治療

4.1 靶向TAEs的臨床治療

新生血管的生成是腫瘤生長的關鍵因素之一，該過程依賴于腫瘤相關內皮細胞的活化與增殖。VEGF被公認為活化血管內皮細胞的重要因子，與內皮細胞表面VEGF受體相結合后，激活下游一系列信號分子(MAPK/ERK、PI3K/AKT)，促進內皮細胞增殖、遷移與血管生成。因此，靶向VEGF-VEGF受體的單抗類藥物和酪氨酸激酶抑制劑一直是腫瘤靶向治療的研究熱點之一。作為第一個問世的血管生成靶向藥物，拮抗VEGF-A的貝伐珠單抗單藥或聯合用藥均被證明對轉移性乳腺癌有一定療效。Du等[27]對共計5210例乳腺癌患者進行Meta分析，結果顯示，與單純化療相比，貝伐珠單抗聯合化療更能有效改善晚期乳腺癌患者客觀緩解率和中位生存期，但高壓尿、蛋白尿、粒細胞數量減少及周圍神經毒性等嚴重不良反應的發生率增加。因此，貝伐珠單抗已被美國FDA撤銷其用于乳腺癌治療的認證。目前，靶向抑制VEGF受體的小分子酪氨酸激酶抑制劑主要有舒尼替尼、索拉非尼，臨床上多用于晚期乳腺癌治療。但是大量臨床研究發現，舒尼替尼單藥應用對晚期乳腺癌治療效果有限，無法有效延長患者無進展生存期和總體生存期，且約三分之一的患者出現不良反應，因此，舒尼替尼不被推薦用于晚期乳腺癌的治療[28]。同樣，索拉菲尼單藥治療的2期臨床研究也未能證明其明顯改善了晚期乳腺癌患者的無進展生存期，無一例患者出現部分或完全緩解，因此，索拉菲尼也不被指南推薦作為單藥治療晚期乳腺癌[29]。究其原因，舒尼替尼和索拉菲尼均作用于癌細胞中多個靶點、多條通路，因此，治療中可能引發“脫靶”效應。在此基因上，研究者開始探討多種小分子酪氨酸激酶抑制劑聯合化療，但嚴重的藥物不良反應很可能會導致臨床結局不理想，仍需進一步研發新的抗血管生成小分子酪氨酸激酶抑制劑，展開相關臨床研究。

4.2 靶向TAMs的乳腺癌治療

TAMs主要來源為外周血單核細胞，在趨化因子的作用下募集入腫瘤組織中并分化為巨噬細胞，參與腫瘤的發生發展。研究發現，CSF1/CSF1R信號軸的激活可觸發趨化因子的級聯反應，誘導單核細胞的成熟及黏附至乳腺癌細胞，接著激活乳腺癌細胞內PI3K-Akt信號通路，促進癌細胞的肺轉移[30]。因此，小分子酪氨酸激酶抑制劑PLX 3397通過靶向抑制腫瘤相關巨噬細胞中CSF1R表達，可抑制TAMs活性并促進T細胞在腫瘤組織中的浸潤。目前，一些臨床試驗正在嘗試PD1抑制劑聯合CSF1R小分子抑制劑治療乳腺癌，希望二者協同效應可促進腫瘤組織中T細胞、B細胞和自然殺傷細胞的浸潤增加，達到長期抑制腫瘤生長甚至防止遠處復發的目的[31]。另外，有效誘導TAMs復極化為具有抗腫瘤作用的M1型巨噬細胞是臨床治療乳腺癌的另一策略。近年來，利用納米復合材料實現光免疫療法成為乳腺癌治療的研究熱點?？蓪AMs從M2型轉化為M1型，實現從“冷腫瘤”(無T淋巴細胞浸潤)向“熱腫瘤”(T淋巴細胞浸潤)的轉變，從而增強免疫治療效果，逆轉腫瘤的耐藥性[32]。同時，多種中醫藥單體或中藥復方被證明也可促進腫瘤相關巨噬細胞的復極化。比如，黃芩主要活性成分黃芩苷可通過誘導巨噬細胞向M1型巨噬細胞復極，進而抑制TGFβ1表達，發揮抗乳腺腫瘤作用[33]。消癖顆粒中關鍵生物活性化合物寶霍甙-I則可抑制TAMs的M2表型極化，減少CXCL1表達和分泌，顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲[34]。

4.3 靶向CAFs的臨床治療

乳腺癌細胞與成纖維細胞間存在相互作用。比如，三陰性乳腺癌細胞可以分泌Hh因子，與附近CAFs上受體結合后，激活SMO促進細胞中FGF5的合分泌，以維持腫瘤細胞的干性。研究者對12例晚期TNBC癌患者給予SMO抑制劑聯合多西他賽治療，共有3例患者病情得到控制，1例患者出現完全緩解[35]。CAFs與腫瘤微環境中免疫細胞的抑制也密切相關。研究發現，激活中CAFs中TGF-β能在小鼠乳腺癌模型中阻斷T細胞的浸潤，并促進PD-L1抗體的效應，而PD-1/PD-L1信號通路的異常激活有助于腫瘤的免疫逃逸[36]。因此，研究者設計了靶向TGF-β和PD-L1的聯合治療方案，所制備的TGF-β/PD-L1雙特異性抗體已在小鼠乳腺癌模型中取得成功，目前正處于臨床研究中[37]。

5 展望

綜上所述，腫瘤微環境作為乳腺癌細胞賴以生存的“土壤”，在腫瘤的發生發展中起到重要作用。因此，深入研究乳腺腫瘤TME的特征，可為乳腺癌的治療提供新思路和可能的新靶點。值得一提的是，腫瘤微環境是一個復雜的共生系統，在腫瘤進展的不同階段，TME細胞的表型和功能都會發生動態變化，并且腫瘤不同分子亞型的TME存在差異。因此，精準靶向腫瘤微環境中的某一細胞發揮抗乳腺腫瘤的作用需要更多的研究投入。相信通過對于腫瘤微環境的不斷深入研究，乳腺癌的治療將取得更大的突破。