MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗中的應用進展 ①

李 萌，羅美玲

( 廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科，廣西 南寧 530021)

質譜(mass spectrometry)是一種利用離子化技術將原本不帶電荷的物質先轉化為帶電荷的離子，再按照各種離子質核比的差異進行分離測定，從而確定待測物中離子種類和含量的方法，廣泛地應用于生物、化學、環境、醫學等領域?；|輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)針對臨床微生物檢驗的需求進行了相應調整與優化，是目前臨床微生物實驗室中應用最為廣泛的質譜技術[1]。

1 MALDI-TOF MS的原理

傳統的細菌/真菌的檢查與鑒定方法存在操作繁瑣，耗時較長，試驗結果不穩定等缺點，導致難以對某些疑難病原微生物做出準確而及時的檢查與鑒定[2]，影響臨床患者的治療。MALDI-TOF MS是一種基于微生物蛋白質指紋圖譜分析的技術，其主要原理是先提取未知微生物蛋白質分子，并利用合適的基質與上述蛋白質分子形成共結晶，在激光照射下使原本不帶電的蛋白質分子電離帶上電荷，然后在電場作用下通過一個真空管道移動(飛行)至檢測器。由于不同質荷比(m/z)的離子抵達檢測器的先后順序不盡相同，便可獲得特異性的蛋白質指紋圖譜，再通過各種算法分析圖譜峰型數據，并與數據庫中的已知微生物蛋白指紋圖譜進行比對，從而確定該未知微生物的種類。

2 MALDI-TOF MS在細菌/真菌檢測與鑒定中的應用

與傳統方法相比，MALDI-TOF MS具有快速、簡便、精確等優勢，鑒定時間可壓縮至15～60 min之內[3-5]，同時準確性達到了新的高度。如Sogawa等[6]利用MALDI-TOF MS對92種共計468株細菌進行了測試，91.7%的菌株被準確鑒定到種，97.0%的細菌被準確鑒定到屬。而在Faron等[7]在一項多中心研究中報告，2263株細菌(共計61種)被準確鑒定到98.2%的種水平及99.8%的屬水平。在真菌鑒定方面，Sendid等[8]使用MALDI-TOF MS與基于生物化學的傳統真菌鑒定方法進行了比對，在臨床常見的28種1207株酵母菌中，MALDI-TOF MS鑒定準確率為97.5%，略高于生物化學法(97.1%)，且時間更短，成本更低。對于絲狀真菌而言，MALDI-TOF MS也能取得很好的鑒定效果，如Mcmullen等[9]利用升級后的商業數據庫對144株曲霉菌進行了鑒定，結果93.6%(133/144)的菌株被準確鑒定到了種水平。

對于臨床上某些罕見的病原體，比如非結核分枝桿菌(NTM)和諾卡菌等，如果按照傳統的表型鑒定方法鑒定菌種，不僅操作繁瑣，且耗時較長。MALDI-TOF MS的出現，給上述病原體的準確鑒定提供了新的選擇。Rodriguez-Temporal等[10]的研究納入了臨床分離到的67種共計1453株非結核分枝桿菌，MALDI-TOF MS成功鑒定出了其中的64種，準確率為95.5%。該研究者還進一步指出，當檢測得分不小于1.60分(scores ≥1.60)時，大部分種類的NTM均鑒定正確，這為質譜檢測NTM閾值分數的設定范圍提供了依據。王蔚等[11]的研究也證實，液體培養的NTM，包括堪薩斯分枝桿菌和膿腫分枝桿菌在內，其MALDI-TOF MS正確鑒定率達到88.46%(69/78)。而對于諾卡菌來說，完善的數據庫及適當的前處理可能會對正確鑒定產生一定的影響。Buckwalter等[12]曾使用了自建數據庫與商業數據庫相結合的模式，使鑒定準確率從原來的42%提高到了90%。王鵬等[13]通過改進樣本前處理方式，將46株諾卡菌的種水平鑒定率從84.8%提高到了93.5%(43/46)。

3 MALDI-TOF MS在細菌分型方面的應用

細菌分型對于聚集性感染暴發的監測至關重要。既有的分子生物學方法，如多位點序列分型(multi locus sequence typing，MLST)及脈沖場凝膠電泳(pulse field gel electrophoresis，PFGE)，在細菌分型方面發揮了強大的作用，但也存在設備昂貴、操作繁瑣、耗時較長、適用性不強等缺點[14]。為了尋求簡便快速、成本低廉的新方法，不少學者利用MALDI-TOF MS高解析度的特點，在細菌分型方面做了嘗試。

大腸埃希菌被分為幾個系統群，A群和B1群與非致病性定植有關，而B2群和D群與腸外疾病有關[15]，其中ST131亞群被認為與醫院感染密切相關[16]。Egli等[17]使用MALDI-TOF MS和PFGE同時對產超廣譜β-內酰胺酶的大腸埃希菌進行分析，發現前者快速簡便，且結果與PFGE一樣可靠。Nakamura等[18]發現指紋圖譜在7650m/z及7707m/z形成的特征性峰型可將大腸埃希菌ST131亞群與其他亞群相區分。彭海等[19]也證實了MALDI-TOF MS對于多重耐藥的大腸埃希菌同源性聚類分析具有較好的潛力。

金黃色葡萄球菌是臨床微生物實驗室中最常見的分離菌之一，具有多種不同的耐藥機制，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)不但耐藥性強，而且也是院內感染的重要來源[20]。Lindgren等[21]先將111株已知PFGE分型的MRSA使用MALDI-TOF MS制成超級圖譜，再利用該超級圖譜進行其它待測MRSA的分型，結果顯示67.4%的待測MRSA分型與PFGE一致。Steensels等[22]嘗試MALDI-TOF MS對新生兒ICU內暴發的MRSA進行直接分型，發現分型結果與PFGE符合率為93%(14/15)，但重復性較差。郭坤山等[23]分析了80株金黃色葡萄球菌臨床分離株，發現質荷比為6812 m/z、7594 m/z和11990 m/z的蛋白峰是區分MRSA和MSSA最主要的特征性峰型，可用于MRSA的快速篩查。

4 MALDI-TOF MS在抗生素耐藥性快速檢測方面的應用

自1928年弗萊明發現青霉素以來，隨著抗生素的大規模使用，細菌對抗生素的耐藥性也與日俱增?？股啬退幮詸z測是臨床微生物實驗室日常主要工作之一，常規的耐藥性檢測方法有紙片法、稀釋法、E-test等，然而上述方法均需要6 h以上的檢測時間，有時不能滿足盡早開始針對性治療的需求，為此不少學者開始著眼于MALDI-TOF MS快速價廉的優勢，嘗試利用該技術進行抗生素耐藥性的快速檢測，目前主要的應用方向包括以下幾個方面。

4.1 基于圖譜特征的快速檢測

某些細菌產生耐藥性之后，由于其表達的蛋白也同時發生了變化，在MALDI-TOF MS檢測圖譜中會體現出某些特定蛋白峰的出現、消失，峰強度(峰高)的變化以及峰坐標位置的改變等特征[24]。這些特征可被特定軟件發現并提取出來，并以此構建出專門針對該種耐藥菌株的自建數據庫。將樣本菌株得到的質譜圖譜與該自建數據庫進行比對，即可快速判定該樣本菌株是否屬于相同耐藥表型[25]。如Centonze等[26]證實，在99.4%(175/176)的產KPC菌株質譜圖譜中存在特異性的11109±8 m/z的蛋白峰，而對照組均缺乏該峰，靈敏度(98.7%)和特異性(100%)均較高；林曉暉等[27]也發現，3853 m/z、4218m/z、4619m/z是用于判定肺炎鏈球菌是否對青霉素敏感的3個最主要的特征峰。

4.2 基于抗生素分解的快速檢測

某些細菌產生的酶能夠將特定抗生素分解為分子量更小的產物。把待測菌株接種于含有特定抗生素的培養基中孵育一段時間后，如果該菌株能夠產生相應的酶，那么抗生素就會被其水解，殘留抗生素及其水解產物的存在會導致反應前后MALDI-TOF MS檢測圖譜峰型發生改變，通過對峰型的分析可以判斷是否存在相應的酶，據此間接推斷待測菌株的耐藥性[28]。如Kost等[29]評估了MALDI-TOF MS對于碳青霉烯耐藥的腸桿菌(CRE)的檢測能力，厄他培南耐藥的檢出率為92.7%(89/96)，亞胺培南耐藥的檢出率為97.9%(94/96)； Sakarikou等[30]使用MALDI-TOF MS對55株來自血培養中的肺炎克雷伯菌進行了厄他培南的水解產物檢測，發現MALDI-TOF MS可以檢測并區分不同的產酶菌株，且結果與傳統藥敏試驗和基因型鑒定完全一致；李翔等[31]研究也指出，MALDI-TOF MS與傳統藥敏試驗及PCR的檢測效能差異無統計學意義(P>0.05)，但前者可大幅縮短檢測時間。

4.3 基于生長特性的快速檢測

細菌或真菌在各個生長階段表達的蛋白具有一定差異性，將待測菌株置于含有梯度濃度抗生素的培養基中，待測菌株受到不同梯度濃度抗生素的抑制，其在相應培養基中的生長特性不同，蛋白表達也不同，利用MALDI-TOF MS檢測各個培養基中的蛋白峰型，利用數學模型計算出綜合相關指數(composite correlation index，CCI)，可以快速判斷待測菌株是否對該抗生素耐藥[32]。如Vella等[33]利用上述方法，將白色念珠菌對棘白菌素抗真菌藥物的敏感性判斷時間由原來的24 ～ 48 h壓縮至3 h。Sparbier等[34]對上述方法進行了改進，不再使用CCI，而是使用MALDI-TOF MS直接逐一檢測各培養基中的質譜圖譜，再通過內標、峰值強度與檢測數值共同計算相對微生物含量，從而判定最小抑菌濃度。Van等[35]對100株多殺巴斯德菌使用上述方法進行耐藥性快速檢測，敏感性和特異性分別為95.7%和100%。

目前，培養與鑒定仍然是臨床上診斷細菌或真菌感染的金標準，但傳統的表型或生化鑒定方法耗時較長，有時難以滿足對病原體尤其是危重癥感染病原體快速診斷的需求。MALDI-TOF MS的出現，縮短了檢測時間，優化了工作流程，且提高了臨床微生物實驗室對于罕見菌、疑難菌、苛養菌、厭氧菌等的鑒定能力。相信未來MALDI-TOF MS的發展重心將是數據庫的不斷擴充與完善，特定軟件的研發與優化，從而拓展以菌株鑒定與分型為核心功能相關的應用場景。

另一方面，不少學者嘗試利用MALDI-TOF MS進行抗生素耐藥性的快速檢測試驗，雖然檢測方法缺乏標準化，但目前的研究已顯示其具有優秀的潛力，未來的研究將會朝著簡便化、標準化、自動化的方向推進，使其接近甚至達到傳統耐藥性檢測方法的水準，能夠精準及時地為臨床用藥提供有力支持。隨著研究的深入進展，MALDI-TOF MS將給臨床微生物實驗室帶來新的革命。