大鼠脂肪組織石蠟切片制作及免疫組織化學顯色方法*

于 暢 李 梁 張立佳 郝文靜 張起帆 于 源 董自豪

（包頭醫學院，1 基礎醫學與法醫學院人體解剖學教研室，2 醫學技術與麻醉學院18級放射學專業，3 第三臨床醫學院19級臨床醫學專業，包頭 014040）

哺乳動物體內的脂肪組織可分為白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）和棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）。白色脂肪組織與棕色脂肪組織擁有不同的代謝特征。白色脂肪組織主要分布于皮下、腎周、腸系膜等部位，其功能是儲存甘油三酯。棕色脂肪組織則能通過非戰栗產熱消耗甘油三酯。近年來，白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉變的研究成為熱點。2種脂肪組織均由大量脂肪細胞簇擁而成，細胞內富含大量脂質成分的脂滴。這種特殊的結構導致經常規脫水、透明、浸蠟程序處理的脂肪組織難以與石蠟融合，質地松軟，導致切片不完整，存在大量的空洞、破碎，難以切出合格的切片。解偶聯蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）作為棕色脂肪組織的特征性蛋白[1]。本研究選取UCP1在大鼠脂肪組織中的表達來檢測制片程序對免疫組織化學顯色是否有影響。筆者摸索出一套大鼠脂肪組織石蠟切片制作及免疫組織化學顯色的具體方法，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

8周齡雄性SD大鼠共10只，平均體質量321～400 g，由斯貝福（北京市）生物科技公司供應，檢驗合格證號為SCXK（京）2019-0010。

抗-UCP1抗體購自Abcam，貨號ab209483；通用二步法免疫組織化學試劑盒（小鼠/兔增強聚合物法檢測系統）購自中杉金橋，貨號PV-9000。

1.2 取材

取材前禁食不禁水12 h，水合氯醛麻醉，解剖大鼠，分離腹股溝區白色脂肪組織及肩胛區棕色脂肪組織。生理鹽水清洗脂肪組織，濾紙吸干表面水分。

1.3 脂肪組織的固定、脫水、透明、浸蠟

將較大塊脂肪組織用取材刀分割成小塊，放置于中性福爾馬林溶液中，固定12 h。用取材刀，將脂肪組織分割成3 mm×3 mm×2 mm小塊，每4～5小塊放置于一個微孔塑料包埋框中。依次用梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟浸蠟。筆者改良前后各步驟時間如表1。

表1 改良前后脫水、透明及浸蠟程序設定的比較

1.4 脂肪組織的包埋

用酒精燈將眼科彎鑷預熱數秒，將脂肪小塊從包埋框中夾出，把脂肪小塊放在石蠟包埋機工作臺的加熱板上，利用加熱板的溫度使石蠟和脂肪組織中的脂滴仍呈液態，接著用彎鑷在脂肪小塊上從上到下、從左到右來回輕柔地均勻擠壓，盡可能將脂肪小塊中的脂滴擠出。包埋模具提前在加熱板上預熱，迅速將處理好的脂肪制作成蠟塊。

1.5 脂肪組織石蠟切片、H-E染色

將包埋好的蠟塊修切好后用切片機切片，切片厚度 5 μm，攤片機水槽內溫度控制在40℃左右，烤片機溫度為60℃，烤片時間不少于1 h。H-E染色，環保中性樹膠封片。

1.6 免疫組織化學顯色

將切片常規脫蠟、脫水；TRIS-EDTA緩沖液抗原修復；抑制內源性過氧化物酶；滴加抗-UCP1抗體（1∶5 000），4℃孵育至次日；PBS沖洗，滴加二抗試劑，室溫孵育10 min；DAB顯色，鏡下觀察顯色程度；蘇木精復染，鏡下觀察細胞核著色；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 2種程序處理的脂肪組織切片及H-E染色比較

改良程序組蠟塊質地均勻，組織完整，呈白色及棕色半透明狀，切片時能連成完整蠟帶，切片無空洞、破碎，組織無褶皺、無裂縫。H-E染色后鏡下可見：白色脂肪組織細胞結構完整，染色清晰，核質分明，透明度好，無擠壓褶皺現象；細胞內呈大空泡狀，細胞核呈橢圓形或類圓形，偏離在邊緣一側，細胞團聚集呈蜂窩狀；棕色脂肪組織形態完整，染色清晰，較白色脂肪組織的細胞排列更為緊密、細胞內有較多小空泡，細胞基質發達，細胞周圍有較多血管（圖1 A1、B1、C1、D1）。

傳統程序組肉眼可見蠟塊完整，與改良組無顯著區別，但切片時較為困難，不易連成蠟帶，切片不完整，存在大量的空洞、破碎，切片上組織存在褶皺、裂隙。有的切片看不到組織。H-E染色觀察到白色脂肪組織細胞團整體結構較為凌亂，存在較多裂隙，細胞核類圓形，清晰可見，部分細胞膜不完整。棕色脂肪組織結構不完整，中央有較多裂縫、空洞，完整部分細胞結構尚清晰（圖1 A2、B2、C2、D2）。

2.2 2種脂肪組織改良程序組石蠟切片免疫組織化學顯色

免疫組織化學顯色中，傳統程序組在清洗過程中偶有脫片，改良程序組2種脂肪組織未出現脫片。鏡下觀察可見，改良程序組背景清晰，細胞膜完整，細胞核清晰可見，白色脂肪組織可見個別棕色點狀顆粒，棕色脂肪組織于細胞內可見大量棕色斑塊的陽性表達，滿足科研需求（圖2 A1、B1）；而在傳統程序組，細胞結構紊亂，細胞膜結構不完整，切片出現裂隙空洞，染色有非特異假陽性斑塊（圖2 A2、B2）。

圖1 2種程序處理的脂肪組織切片及H-E染色。A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2：H-E染色，×400，標尺=100 μm；A1、B1：改良程序組白色脂肪組織H-E染色；C1、D1：改良程序組棕色脂肪組織H-E染色；A2、B2：傳統程序組白色脂肪組織H-E染色；C2、D2：傳統程序組棕色脂肪組織H-E染色.圖2 2種程序處理的脂肪組織UCP1免疫組織化學顯色，×400 ，標尺=100 μm。A1：改良程序組UCP1在白色脂肪組織中的表達；A2：傳統程序組UCP1在白色脂肪組織中的表達；B1：改良程序組UCP1在棕色脂肪組織中的表達；B2：傳統程序組UCP1在棕色脂肪組織中的表達.

3 討論

白色脂肪組織與棕色脂肪組織形態學及代謝特征均不同，其對健康的影響也截然不同。白色脂肪組織容易堆積，與肥胖癥、高脂血癥、糖尿病有著密切聯系；而棕色脂肪組織則能通過產熱消耗脂肪，對控制體脂、預防疾病有著積極的作用。近年來，白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉化的研究成為熱點。

對于脂肪組織的形態學研究，普遍采用石蠟包埋切片染色技術，石蠟切片制作過程中可脫去細胞中脂質成分，能很好的觀察脂肪細胞形態，準確地定位抗原，并且石蠟切片能長期保存。也有學者采用冰凍切片的方法處理脂肪組織，但脂肪組織幾乎不含水分，脂質成分不易結冰，難以像其他組織被凍硬，快速冰凍產生的冰晶也會對組織結構造成破壞，影響抗原定位，且冰凍切片不易長期保存，故冰凍切片在臨床診斷上應用較多，但在科研領域有較多局限性[2-3]。

棕色脂肪組織區別于白色脂肪組織就在于其非震顫自主產熱功能，從分子水平則表現為更高的UCP1表達量和耗氧量。換而言之，UCP1的表達量也決定著這種脂肪組織產熱功能的水平。UCP1通過引起線粒體氧化呼吸鏈的電子傳遞和ATP生成之間解偶聯，降低脂肪酸氧化代謝的產能效率，進而實現棕色脂肪細胞釋放熱量的功能[4]。UCP1為經典的棕色脂肪標志蛋白，因此選取UCP1在大鼠脂肪組織中的表達來檢測制片程序對免疫組織化學顯色是否有影響。

全部10只大鼠脂肪組織石蠟包埋后切片H-E染色和免疫組織化學顯色，鏡下觀察并采集圖像。所有H-E染色圖像細胞結構清晰，核質著色良好，無擠壓和皺縮現象。2種脂肪組織特征明顯，易于分辨。免疫組織化學顯色中，細胞結構完整，細胞核清晰可見，白色脂肪組織未見明顯陽性表達，棕色脂肪組織呈陽性表達。結果表明筆者所述的大鼠脂肪組織石蠟切片制作方法是成功的。

大鼠脂肪組織石蠟切片制作的成功與否關鍵技術難點有3個方面。①取材：相對于大塊脂肪組織而言，較小的組織塊更易于乙醇、二甲苯、石蠟完全滲透進入組織，在多次使用傳統大小組織塊（2.0 cm×1.0 cm×0.3 cm）失敗后，筆者將脂肪分割成3 mm×3 mm×2 mm小塊，多個小塊放于一個包埋框中，最后制成一個蠟塊。較小的組織塊能得到較好的脫水、透明以及浸蠟效果，也不會影響后續觀察。②固定：固定一定要徹底，這是制備各種病理切片都至關重要的步驟。固定液至少為脂肪組織體積的50倍，用紗布覆蓋以避免脂肪組織因懸浮在液體表面而造成固定不全。固定的目的是為了防止組織的自溶與腐敗，以保持組織或細胞原有的結構。良好固定的組織呈一定的硬化狀態，增加了組織的韌性，而且不易變形，有利于后續的脫水、透明、浸蠟、包埋及切片。徹底的固定可以更好的保證細胞膜的完整性，這在一定程度上可延長組織的脫水時間，并且在乙醇脫水、二甲苯透明及浸蠟的過程緩慢而溫和，不會過于劇烈而引起組織的變形。固定時間也不宜太長，時間太長可能會造成抗原性丟失，固定時間以12 h為宜。③脫水、透明及浸蠟：傳統上認為細胞中的脂滴容易被乙醇、二甲苯等有機溶劑溶解，但近年來有研究表明：相對于乙醇，二甲苯有著更好的溶解置換脂滴的效果[5]。故此，筆者改良的脫水、透明、浸蠟程序中，大大延長了100%乙醇溶液脫水以及二甲苯透明時間，以求盡可能置換出脂肪細胞中的大量脂滴。并且，筆者參考文獻[6-8]，在包埋前增加了使用眼科鑷擠壓脂肪塊的步驟。在包埋前將脂肪小塊放于石蠟包埋機加熱板上，利用加熱板上的高溫使脂滴仍然呈液態，用乙醇燈預熱眼科鑷，接著在脂肪組織上輕輕適當地擠壓，使在脂肪組織中不能置換掉的脂滴盡量地擠出。改良程序處理的脂肪組織中，脂肪細胞中的脂滴被乙醇充分置換，進而也能被透明劑二甲苯以及石蠟充分置換，進而達到支撐細胞的作用，從而也能使蠟塊質地均一，脂肪組織較軟；將脂滴完全置換，也能使組織塊得到充分的硬化，有助于后期的石蠟制片。傳統程序組中，脫水不盡，脂滴不能充分被置換，二甲苯則不能完全滲入，蠟液更不能完全滲入組織，達不到支撐組織的作用，組織較軟，蠟塊質地不均一，切片質量差，易出現組織破碎、空洞、重疊。

筆者改良的大鼠脂肪組織石蠟切片制片方法，通過改良組織脫水、透明、浸蠟程序以及包埋方法，在不增加微波熱固定、丙酮脫脂等復雜處理的同時[9-10]，有效提高了制片質量，能滿足后續研究需求，值得在科研領域推廣。