以聚乙二醇水凝膠膜為載體構建的角膜上皮移植片對LSCD治療的可行性

郭譯遠 賢惠敏 Shereen Tan Qiang Fu,4 金鑫 Mark Daniel Greg.G.Qiao 張弘

1哈爾濱醫科大學附屬第一醫院眼科醫院，哈爾濱 150001；2哈爾濱醫科大學附屬第二醫院心血管內科，哈爾濱 150001；3墨爾本大學化學與生物分子工程系，墨爾本 3001；4悉尼理工大學土木與環境工程系，悉尼 2000；5澳大利亞眼科研究中心皇家維多利亞眼科耳科醫院，墨爾本 3002

角膜緣干細胞移植是治療角膜緣干細胞缺乏癥(limbal stem cell deficiency，LSCD)的有效辦法，但是由于自體移植取材受限和異體移植排斥反應等問題，移植手術受到較大限制。角膜緣干細胞(limbal stem cells，LSCs)可分化成角膜上皮細胞(corneal epithelial cells，CECs)，但手術、外傷、感染等因素損傷LSCs后可引起LSCD，導致角膜完整性和透明性的喪失，最終出現角膜結膜化、血管化等眼表慢性炎癥改變[1-2]。目前，LSCs移植手術被認為是恢復LSCs儲備、重建眼表結構和治療LSCD的有效辦法。其中，自體角膜緣干細胞移植不存在免疫排斥，移植成功率高，但是僅適合單眼小范圍損傷的患者，而且也有因手術操作導致健側眼出現不可逆損害者。異體角膜緣干細胞移植治療適合雙眼大范圍損傷的患者，但存在供體角膜源不足、免疫排斥反應等問題[3]。近年來，隨著組織工程學的發展，利用組織工程的方法體外擴增CECs、構建上皮移植片為治療LSCD提供了新的途徑，可以有效解決自體和異體角膜緣干細胞移植的相關問題，為治療LSCD提供了新途徑。載體的正確選擇對組織工程的成功具有決定意義，目前常用的CECs載體包括羊膜、絲素蛋白膜、膠原水凝膠、殼聚糖水凝膠等[4-5]，這些載體均有透光度較差、供體間差異大、不穩定、機械強度差等缺點[6-7]，因此尋找一種合適的CECs組織工程載體勢在必行。研究團隊前期的實驗已經證明，聚乙二醇水凝膠膜(polyethylene glycol hydrogel films,PHFs)作為一種新型擴增載體，具有透光度高、韌性強、免疫排斥反應小、制作成本低、可批量生產等優點[8]，推測其可作為載體實現CECs的體外擴增，進而構建工程化角膜上皮，但目前鮮見相關研究報道。本研究擬以PHFs為載體在體外構建工程化角膜上皮移植片并進行LSCD治療的在體研究，評估該工程化角膜上皮移植片重建眼表結構的可行性，為臨床上治療LSCD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康清潔級新西蘭白兔19只，雌雄不限，體質量2～3 kg，兔齡5～6個月，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物中心提供。本實驗方案經哈爾濱醫科大學附屬第一醫院科研和臨床試驗倫理委員會批準(批文號：2021006)。實驗動物的使用遵守美國國立衛生研究院頒布的實驗動物使用和護理原則。

1.1.2主要試劑及儀器 癸二酰氯(sebacoyl chloride，SC)、聚氧乙基甘油醚(glycerol ethoxylate，GE)、聚已酸內酯(polycaprolactone，PCL)二醇(美國Sigma-Aldrich公司)；甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美國Sigma-Chemical公司)；TUNEL檢測試劑盒(美國R&D Systems公司)；熒光素鈉(天津晶明公司)；小鼠抗角蛋白(AE1/AE3)抗體(北京中山金橋公司)；DAPI(美國Santa Cruz公司)；小鼠抗p63抗體(ab110038，英國Abcam公司)；山羊抗小鼠IgG抗體(1583138)、猴抗鼠IgG抗體(1608644)(美國Life Technologies公司)；妥布霉素地塞米松眼膏(瑞士諾華公司)。掃描電子顯微鏡(PharosG1，荷蘭飛納公司)；手術顯微鏡(XT-X-8A，湖南梅溪湖新城醫療投資有限公司)；光學顯微鏡(Leica DM1000，德國徠卡公司)；裂隙燈顯微鏡(SL-3G，日本拓普康公司)。

1.2 方法

1.2.1PHFs的合成 將PCL二醇(0.104 g，10 wt% PCL)溶解在二氯甲烷(15 ml)中合成二羥基聚己內酯(dihydroxy polycaprolactone，DPCL)溶液，將GE(0.62 ml，0.70 mmol/L)、SC(0.30 ml，1.42 mmol/L)添加到DPCL溶液中，充分混合，室溫靜置1 h。取7.5 ml溶液加入直徑10 cm玻璃培養皿中，置于真空烤箱中60 ℃加熱30 min，取出冷卻1 h至室溫。用無菌手術刀將膜的周邊切除，并在培養皿中加入去離子水20 ml，浸泡15 min，用四氫呋喃水代替去離子水(1∶ 1，40 ml)繼續浸泡。將薄膜取出置于250 ml蒸餾水中，每15 min更換1次洗液，重復3次，將PHFs在25 kGy的γ輻照下滅菌。

1.2.2PHFs理化性質檢測 (1)PHFs厚度 在低真空條件下，將PHFs安裝在碳片上，通過掃描電子顯微鏡觀察薄膜的水化厚度。使用樣品架調整傾斜度，觀察PHFs的橫截面。(2)PHFs透光度 將PHFs在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中浸泡1 h后置于紫外下照射，記錄在25 ℃條件下290～750 nm的透光度。(3)PHFs機械拉伸性能 將PHFs置于PBS溶液中膨脹至平衡，切成2 cm×2 cm大小、骨頭形狀的薄膜以評價其拉伸性能。在35 ℃水浴溫度下，用50-N測壓元件以0.1 mm/s速率拉伸被夾住的樣品，直至在測量區域發生斷裂。所有計算均假設泊松比為0.5。

1.2.3角膜緣上皮細胞的原代培養 取清潔級新西蘭大白兔4只，以過量戊巴比妥鈉麻醉處死實驗兔，無菌條件下迅速摘取8只眼球，用PBS反復沖洗后浸泡于含質量分數3%青鏈霉素雙抗的PBS中。手術顯微鏡下，按照無菌操作原則，再次將角膜組織用含3%青鏈霉素雙抗的PBS沖洗數次，去除殘留結膜組織，切取包括Vogt柵欄區大小約1 mm寬的角膜緣組織，移入超凈臺內，再次用含雙抗的PBS沖洗數次，用眼科顯微剪切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，正面朝下貼在24孔板內，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內原代培養，隔日換液。待細胞爬滿孔底，進行傳代培養，倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞每日生長情況。

1.2.4光學顯微鏡下觀察細胞黏附情況 將細胞分為對照組和PHFs+CECs組，分別種植于普通96孔板和帶有PHFs的96孔板中，細胞密度均為30%，24 h后在普通光學顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取3個相同面積視野計數貼壁細胞數，取平均數。

1.2.5熒光顯微鏡下觀察培養細胞中角蛋白標志物AE1/AE3和干細胞標志物p63的表達 為了確定原代細胞培養純度和角膜上皮干性，選擇AE1/AE3和p63染色進行驗證。待細胞長至約80%時，棄去培養液，PBS沖洗；質量分數4%多聚甲醛中固定15 min，PBS沖洗；封閉液(PBS+質量分數10%BSA+體積分數0.1% Triton X-100)封閉1 h；加入一抗(AE1/AE3、p63)，4 ℃濕盒過夜，PBS沖洗；加入熒光二抗，室溫下避光孵育1 h，PBS沖洗；加入DAPI染核15 min，PBS沖洗；甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并記錄。陽性率根據熒光染色陽性細胞百分比進行統計，采用免疫組織化學HSCORE定量法進行計算。實驗重復3次，取平均值。

1.2.6MTT法檢測角膜上皮在PHFs上的增生情況 將細胞分為陰性對照組、陽性對照組和PHFs+CECs組，其中陰性對照組將細胞直接種植在培養皿底，加入普通細胞培養液，陽性對照組將細胞種植在培養皿后加入含有100 μmol/L H2O2的普通細胞培養液，PHF+CECs組將細胞種植在鋪有PHFs的培養皿中用普通細胞培養液培養，各組培養24 h。將相同密度和體積的角膜上皮細胞懸液分別接種于96孔板內，每組設6個復孔，96孔板周圍用PBS填充，37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h，加入MTT溶液10 μl/孔，培養箱內避光孵育4 h，棄去培養液，加入二甲基亞砜200 μl/孔，室溫下置于低速搖床10 min，測定波長490 nm處的吸光度(A490)值。每組實驗重復3次，取平均值。

1.2.7TUNEL法檢測角膜上皮在PHFs上的凋亡情況 細胞分組處理同1.2.6。將細胞用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，體積分數3% H2O2封閉10 min，0.1% Triton在4 ℃穿透3 min，加TUNEL反應混合液(A液和B液體積比為1∶ 9)于37 ℃避光孵育1 h，DAPI避光染核15 min，熒光顯微鏡下掃描并拍照，根據TUNEL陽性細胞數/DAPI陽性細胞數計算TUNEL陽性細胞率。實驗重復3次，取平均值。

1.2.8構建LSCD兔模型及動物實驗分組 取清潔級新西蘭大白兔15只，在文獻[9]方法的基礎上加以改良建立LSCD模型。以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)全身麻醉實驗兔，每30 min補充2～4 mg/kg。麻醉后置開瞼器，用顯微剪環形剪去全周角鞏膜緣組織(內2 mm至外2 mm，深度100～150 μm)，并用角膜刮匙刮除直徑6 mm范圍的中央角膜上皮。采用隨機數字表法將建模成功的實驗兔分為3個組，每組5只，均取右眼為實驗眼。對照組為空白對照，造模后不給予任何處置；PHFs組為陰性對照，造模后將直徑為12 mm的空PHFs膜置于LSCD兔模型的角膜表面；PHFs+CECs組將CECs傳代后同時種植于5個直徑為12 mm的PHFs上構建組織工程移植片，細胞密度為(2 118±32)個/cm2，隨后將移植片置于LSCD兔模型的角膜表面。所有實驗動物完成處置后在上下眼瞼正中置褥式牽引縫線，并用活結結扎行暫時性眼瞼縫合。各組術后給予左氧氟沙星滴眼液和地塞米松磷酸鈉滴眼液點眼，每天3次，連續14 d。

1.2.9熒光素鈉染色法檢測各組實驗兔角膜缺損面積大小 于手術當日(0 d)及術后3、5、7、14 d行角膜熒光素鈉染色。實驗兔麻醉后，松開褥式縫線的線結，用質量分數0.2%熒光素鈉溶液10 μl滴加到實驗兔角膜表面，30 s后使用裂隙燈顯微鏡的鈷藍光觀察染色面積，并行眼前節照相。熒光素鈉染色評分標準：無損傷為0分，<1/8損傷面積為1分，≥1/8～<1/4損傷面積為2分，≥1/4～<1/2損傷面積為3分，≥1/2損傷面積為4分[10]。實驗重復3次，取平均值。完成操作后拉攏褥式縫線繼續閉合眼瞼。

1.2.10蘇木精-伊紅染色檢測各組實驗兔角膜上皮組織學特點 14 d后取下實驗兔角膜行蘇木精-伊紅染色，將組織塊用質量分數10%中性甲醛固定后，依次在100%、100%、95%、80%乙醇，以及二甲苯中脫水、透明。石蠟包埋，切片，然后依次在二甲苯、乙醇中脫蠟、水化，用蘇木素和伊紅染色。接著在不同濃度梯度(100%、100%、95%、80%)的乙醇、二甲苯中脫水透明，甘油封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PHFs的理化特性

PHFs是一種人工合成的透明水凝膠薄膜，由DPCL、GE和SC 3種物質在60 ℃下交聯而成(圖1A)。掃描電子顯微鏡下可見，PHFs表面光滑、截面均一，厚度不超過150 μm(圖1B)。紫外可見光透過率觀察進一步顯示，當光線從紫外光譜移動到可見光光譜時，PHFs在增加透光率方面與人眼角膜相似，在400～700 nm具有>99%的透過度(圖1C)。此外，拉伸測試表明，PHFs拉伸度好，能承受約6 MPa的拉力(圖1D)，可滿足手術操作要求。

圖1 PHFs的合成過程及理化特性 A：PHFs合成過程 B：PHFs厚度(標尺=200 μm) C：PHFs透光度 D：PHFs的拉伸能力 PCL：聚已酸內酯；DCL：二氯甲烷；PHFs：聚乙二醇水凝膠膜Figure 1 Synthesis and physicochemical properties of PHFs A：Synthesis of PHFs B：Thickness of PHFs (bar=200 μm) C：Transmittance of PHFs D：Tensile strength of PHFs PCL:polycaprolactone;DCM:dichloromethane;PHFs：polyethylene glycol hydrogel films

2.2 角膜上皮中角蛋白和干細胞標志物的表達

原代細胞培養純度和角膜上皮干性檢測結果顯示，AE1/AE3染色后，大部分細胞的細胞質呈紅色，陽性率為(98.60±2.40)%(圖2)；p63染色后，多數細胞的細胞核呈綠色，陽性率為(61.20±3.60)%(圖3)。

圖2 原代培養角膜上皮中角蛋白AE1/AE3的表達(×400，標尺=12.5 μm) AE1/AE3染色后，大部分細胞的細胞質呈紅色 A：AE1/AE3染色 B：DAPI染色 C：融合圖Figure 2 Expression of keratin AE1/AE3 in primary cultured corneal epithelium (×400，bar=12.5 μm) Red AE1/AE3 staining was seen in cytoplasm of most cells A:AE1/AE3 staining B:DAPI staining C:Overlay

圖3 原代培養角膜上皮中角蛋白p63的表達(×400，標尺=12.5 μm) AE1/AE3染色后，大部分細胞的細胞核呈綠色 A：p63染色 B：DAPI染色 C：融合圖Figure 3 Expression of keratin p63 in primary cultured corneal epithelium (×400，bar=12.5 μm)Green p63 staining was seen in nuclei of most cells A:p63 staining B:DAPI staining C:Overlay

2.3 各組PHFs上的細胞黏附情況比較

細胞貼壁結果顯示，PHFs+CECs組和對照組貼壁細胞數分別為(2 282.33±144.00)個/cm2和(2 148.00±77.60)個/cm2，差異無統計學意義(t=1.70，P>0.05)。繼續培養3 d，可見2個組細胞均呈圓形或橢圓形，排列緊密，細胞形態及大體數目均無明顯差異(圖4)。

圖4 PHFs+CECs組與對照組細胞黏附情況比較(×100，標尺=200 μm) PHFs+CECs組細胞貼壁數目與對照組相比無明顯差異A：對照組 B：PHFs+CSCs組Figure 4 Cell adhesion in two groups (×100，bar=200 μm) There was no significant difference in the number of adherent cells between control group and PHFs+CECs group A：control group B：PHFs+CSCs group

2.4 各組PHFs的細胞毒性比較

MTT實驗結果顯示，PHFs+CECs組、陰性對照組和陽性對照組A490值分別為0.59±0.01、0.65±0.07和0.06±0.04，總體比較差異有統計學意義(F=12.25，P<0.05)，其中PHFs+CECs組和陰性對照組A490值明顯大于陽性對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)。TUNEL檢測結果顯示，PHFs+CECs組和陰性對照組無TUNEL陽性細胞，陽性對照組可見較多TUNEL陽性細胞。PHFs+CECs組、陰性對照組和陽性對照組TUNEL陽性細胞率分別為(1.68±0.25)%、(1.17±0.36)%和(62.35±3.68)%，總體比較差異有統計學意義(F=13.45，P<0.05)，其中PHFs+CECs組和陰性對照組TUNEL陽性細胞率明顯低于陽性對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)(圖5)。

圖5 各組PHFs的細胞毒性情況比較 A：3個組A490值比較 F=12.25，P<0.05.與陽性對照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=3) B：3個組細胞凋亡率比較 F=13.45，P<0.05.與陽性對照組比較，aP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=3) C：各組TUNEL染色情況(×400，標尺=50 μm) PHFs+CECs組和陰性對照組均未見細胞核著染為綠色(TUNEL陽性細胞)，陽性對照組可見較多細胞核著染為綠色；所有細胞核著染為藍色，3個組藍色細胞核數量接近 PHFs：聚乙二醇水凝膠膜；CECs：角膜上皮細胞Figure 5 Comparison of cytotoxicity of PHFs among three groups A：Comparison of A490 values F=12.25，P<0.05.Compared with positive control group，aP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=3) B：Comparison of apoptosis rates F=13.45，P<0.05.Compared with positive control group，aP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=3) C：TUNEL staining (×400，bar=50 μm) Green nuclear staining of TUNEL-positive cells was not seen in PHFs+CECs group and negative control group，and was observed in positive control group.The nuclei of all cells were stained blue，and the number of blue nuclei in the three groups was similar PHFs：polyethylene glycol hydrogel films；CECs：corneal epithelial cells

2.5 各組LSCD實驗兔角膜缺損面積和角膜上皮組織學特點比較

熒光素染色結果顯示，造模前，3個組實驗兔眼表均未見熒光染色；手術當日(0 d)，3個組實驗兔眼表滿布綠色熒光，證明LSCD模型造模成功。隨著術后時間的延長，各組角膜熒光素鈉染色評分均降低，對照組、PHFs組和PHFs+CECs組角膜熒光素鈉染色評分依次降低，3個組不同時間點熒光素鈉染色評分總體比較，差異均有統計學意義(F分組=41.81，P<0.01；F時間=42.52，P<0.01)，其中對照組術后7 d角膜熒光素鈉染色評分明顯低于術后3 d，PHFs組術后0、3、7、14 d角膜熒光素鈉染色評分均較前一時間點明顯降低，PHFs+CECs組熒光素鈉染色評分術后3 d較術后0 d、術后7 d較術后3 d均明顯降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)；術后3、7、14 d，PHFs+CECs組熒光素鈉染色評分均明顯低于對照組和PHFs組，差異均有統計學意義(均P<0.05)(圖6A，表1)。

圖6 各組LSCD兔角膜缺損面積和角膜上皮組織學特點比較 A：造模前，3個組實驗兔眼表均未見熒光染色；手術當日(0 d)，3個組實驗兔眼表布滿綠色熒光，隨著術后時間的延長，各組角膜熒光染色逐漸減少 B：對照組結膜重度水腫，出現大量分泌物，角膜混濁呈白色，虹膜窺不清；PHFs組結膜輕度水腫，角膜彌漫水腫，虹膜輕度充血；PHFs+CECs組結膜無水腫，角膜局部水腫，虹膜正常 C：蘇木精-伊紅染色結果顯示，對照組存在較少形狀不規則的角膜上皮細胞，PHFs組一些區域出現單層稀疏的角膜上皮細胞；PHFs+CECs組角膜上皮覆蓋范圍最大，細胞層數增加到3～5層，形態較規則，排列較緊密(×100，標尺=150 μm) PHFs：聚乙二醇水凝膠膜；CECs：角膜上皮細胞Figure 6 Comparison of corneal defect area and histological characteristics of corneal epithelium in LSCD rabbits A：Before modeling，no luciferin sodium staining was observed on the ocular surface of rabbits in the three groups.On the day of operation (0 d)，the ocular surface of rabbits in the three groups was full of luciferin sodium staining，and the staining decreased gradually with the extension of postoperative time B：In control group，severe conjunctival edema，a large amount of secretions，turbid and white cornea as well as unclear iris were observed.In PHFs group，mild conjunctival edema，diffuse corneal edema and mild iris congestion were seen.In PHFs+CECs group，conjunctival edema was not found,and local corneal edema were seen and iris was normal C：Hematoxylin-eosin staining results showed that there were fewer irregularly shaped corneal epithelial cells in the control group，while a single layer of sparse corneal epithelial cells appeared in some areas of the PHFs group.In the PHFs+CECs group，the corneal epithelium coverage was the largest，and the cell layers increased to 3-5.The morphology was regular and the arrangement was close (×100，bar=150 μm) PHFs：polyethylene glycol hydrogel films；CECs：corneal epithelial cells

表1 各組LSCD實驗兔不同時間點角膜熒光素鈉染色評分比較(x±s,分)Table 1 Comparison of corneal fluorescein sodium staining scores of LSCDrabbits among different groups at different time points (x±s,score)組別樣本量不同時間點熒光素鈉染色評分0 d3 d7 d14 d對照組54.00±0.003.60±0.552.60±0.55b2.00±0.71PHFs組54.00±0.003.40±0.55a2.20±0.45b1.60±0.55cPHFs+CECs組54.00±0.001.80±0.45ade0.60±0.55bde0.20±0.45de 注:F分組=41.81,P<0.01;F時間=42.52,P<0.01;F交互作用=0.13,P=0.97.與同組0 d比較,aP<0.05;與同組3 d比較,bP<0.05;與同組7 d比較,cP<0.05;與同時間點對照組比較,dP<0.05;與同時間點PHFs組比較,eP<0.05(重復測量兩因素方差分析,LSD-t檢驗) LSCD:角膜緣干細胞缺乏癥;PHFs:聚乙二醇水凝膠膜;CECs:角膜上皮細胞 Note:Fgroup=41.81,P<0.01;Ftime=42.52,P<0.01;Finteraction=0.13,P=0.97.Compared with the same group at day 0,aP<0.05;compared with the same group at day 3,bP<0.05;compared with the same group at day 7,cP<0.05;compared with control group at corresponding time points,dP<0.05;compared with PHFs group at corresponding time points,eP<0.05 (Two-way re-peated measures ANOVA,LSD-t test) LSCD:limbal stem cell deficiency;PHFs:polyethylene glycol hydrogel films;;CECs:corneal epithelial cells

裂隙燈顯微鏡普通光照下觀察可見，14 d時對照組結膜重度水腫，出現大量分泌物，角膜混濁呈白色，虹膜窺不清；PHFs組結膜輕度水腫，角膜彌漫水腫，虹膜輕度充血；PHFs+CECs組結膜無水腫，角膜局部水腫，虹膜正常(圖6B)。

蘇木精-伊紅染色結果顯示，對照組存在較少形狀不規則的角膜上皮細胞，甚至一些區域未再上皮化，與上述熒光素結果一致；PHFs組一些區域出現單層稀疏的角膜上皮細胞，再上皮化不明顯；PHFs+CECs組角膜上皮的覆蓋范圍最大，細胞層數增加到3～5層，形態較規則，排列較緊密(圖6C)。

3 討論

組織工程為角膜上皮移植片提供了批量生產的途徑，并且克服了自體移植取材受限和異體移植的排斥反應問題，是目前較優越的治療方法。但是不同的載體各有優缺點，目前組織工程學常用的載體是羊膜，但羊膜作為一種天然生物材料，各批次之間差異大、存在疾病傳播風險等[11]。合成生物材料領域中研究較熱的載體包括膠原、絲素蛋白、角蛋白、溫敏材料、殼聚糖等，但存在韌性差、降解過快、透明度差、強度不足等問題[12]。所以，尋找并構建一種更適合角膜上皮種子細胞生長、生物相容性更高、免疫排斥反應更小的載體支架勢在必行。

本實驗制備了一種超薄PEG水凝膠膜PHFs，從體外和體內水平研究了其作為角膜上皮細胞體外擴增的載體并移植用于治療兔LSCD的可行性，結果顯示PHFs較薄、韌性強、透光度高、安全無毒、生物相容性好，適合用作角膜上皮移植片；PHFs能夠體外擴增、移植角膜上皮并促進兔LSCD角膜的再上皮化。

水凝膠是一種具有網絡結構的親水性多聚物，與細胞外基質成分相似，既能保持一定的形狀，又能吸收大量的水分[13-14]。這種結構使其具有良好的生物相容性，并且對水溶性代謝產物，如葡萄糖、氧氣等有很高的通透性[15]，目前已經廣泛應用于組織工程支架、藥物釋放系統、軟組織替代物等生物領域。水凝膠可分為天然水凝膠和合成水凝膠，天然水凝膠主要包括海藻酸、透明質酸、殼聚糖、膠原、纖維素等[16]，合成水凝膠主要包括聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚丙烯酸-2-羥乙酯等[17-20]。PHFs最重要的組成部分PEG水凝膠具有無毒、透明、穩定、生物相容性好、免疫原性低、抑制非特異性蛋白吸收、融合生物物理和生物化學特性等優點[21-23]。我們前期利用PHFs體外擴增了角膜內皮[8]，為進一步擴增角膜上皮提供了充分的研究基礎。本研究中通過對PHFs的理化特性分析可知，合成的PHFs厚度較薄、表面光滑、韌性強、透明度高，滿足了成為合格的眼表載體所需要的物理條件。此外，用于合成PHFs的3種化學成分癸二酰氯、聚氧乙基甘油醚、聚已酸內酯二醇均無化學毒性。癸二酰氯是一種二酸，來自于天然的癸二酸[24]。聚氧乙基甘油醚是一種無毒的親水性支狀聚合物，由3個聚乙二醇臂組成，廣泛用于紡織工業、潤滑油、金屬清洗、造紙工業、印染工業、石油工業等。聚已酸內酯二醇是一種可生物降解的無毒性脂肪族聚酯，可賦予材料高拉伸伸長率性能，已獲得美國食品藥品監督管理局批準用于人體[5]。本研究體外細胞毒性和凋亡實驗結果證實，PHFs及其降解產物不會對細胞增生產生影響。

水凝膠能使細胞黏附及生長是其可以用于組織工程材料領域的關鍵。本研究角膜緣細胞黏附測試結果表明，在PHFs上和普通培養皿上細胞貼壁能力相似。以往用PEG作為細胞載體的研究，由于PEG的抗蛋白特性，在使用PEG材料時必須加入膠原或其他黏著劑以利于細胞黏附和貼壁[23]。

構建角膜移植片的關鍵，除了制備具有優良特性的載體外，提供優質的供體細胞也至關重要。本實驗通過角膜緣組織的原代培養，提供具有更高干性的角膜上皮細胞。為了驗證供體細胞的種類和計算干細胞比例，使用熒光顏料進行角蛋白和干細胞標志物的觀察。AE1/AE3能特異性地識別包括CK3在內的一組酸性角蛋白，在角膜緣處的角膜上皮中呈陽性反應，在角膜中央處的角膜上皮中呈陰性反應[24]。p63是一種觸發角化細胞分化的核轉錄因子，在角膜中主要表達于角膜緣上皮的基底層，被認為是LSCs的特異性標志物[25]。本實驗獲得的供體細胞是純度較高、干性較強的角膜上皮細胞，為今后實驗兔眼表角膜上皮的再生可以提供充足的來源。

LSCs是角膜上皮細胞再生的來源，若角膜干細胞保存完好，則角膜上皮在2～3 d內可恢復完全。因此，本研究選擇在刮除角膜上皮的基礎上，進一步剪除部分角膜緣組織，延緩角膜上皮修復，利于實驗觀察。體內實驗中，攜載角膜上皮的PHFs移植片對上皮缺損的恢復十分有利，14 d后角膜缺損面積大幅度縮小，剩余約5%，證明角膜上皮細胞再生能力較強，能覆蓋整個眼表，形態正常。此外，角膜水腫、角膜透明度、新生血管程度較對照組均有所改善，由此證明PHFs是攜載及移植角膜上皮細胞的優良載體，并且對眼部無毒性。我們前期將PHFs角膜內皮移植片移植到LSCD實驗兔角膜內表面，經過28 d的裂隙燈顯微鏡下觀察，亦發現PHFs內皮移植組的角膜依然保持透明，無角膜水腫等毒性表現[8]。由于在合成生物材料領域中，尚無已上市、公認的眼科材料可以作為陽性對照，所以本研究體內實驗僅選擇空白PHFs作為陰性對照。結果顯示，無上皮細胞攜載的PHFs移植片雖然對角膜上皮的恢復影響不大，但是與對照組相比，仍能起到一定的修復作用，推測與該膜減少了眼瞼摩擦對角膜上皮再生的損害有關。

本研究PHFs動物實驗結果為日后進一步開展LSCD患者的臨床試驗提供了基礎。PHFs的使用將在一定程度上緩解角膜供體資源緊張的壓力，擴寬角膜移植手術的思路。此外，PHFs載體的合成為角膜組織工程學提供了新的依據，PHFs不僅可以作為其他實驗細胞移植的載體，還可以作為人工合成載體材料的模板。關于PHFs的研究尚有很多問題有待解決，如PHFs的鏡片含水量、透氧率是否能夠滿足要求，PHFs的降解產物進入血液循環后是否會影響其他器官的功能、工程化角膜上皮移植片的免疫排斥等相關問題，我們將在后續研究中進一步探討。

利益沖突本研究所有作者均聲明與任何組織或實體無任何相關的利益沖突

作者貢獻聲明郭譯遠：參與設計實驗、實施研究、采集整理數據、分析解釋數據、論文撰寫；賢惠敏、Shereen Tan、Qiang Fu：參與實施研究、采集數據、分析解釋數據、論文撰寫；金鑫：參與設計實驗、數據整理；Mark Daniel、Greg.G.Qiao：參與分析解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱；張弘：參與設計實驗、分析解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱