棕色化和白色化條件下脂肪組織KLF7的差異表達分析

唐意涵，馬丁凌，梁毛迪，袁成鋼，李夢環，侯艷婷，孫超月，張君

(石河子大學醫學院/新疆地方病與民族高發病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000)

肥胖已成為一個全球性的公共健康問題，并且與心血管疾病和2型糖尿病等疾病密切相關[1]。肥胖主要是由于機體能量的攝入量長期大于消耗量，多余的能量以甘油三酯的形式儲存在脂肪組織中而導致[2]。傳統觀點認為哺乳動物有兩種脂肪組織：白色脂肪組織(White adipse tissue, WAT)和棕色脂肪組織(Brown adipose tissue, BAT)。其中白色脂肪組織最為常見，并發現作為皮下組織，分布在腹部、大腿和腰部，而棕色脂肪組織主要分布在血管周圍、心外膜、腎上腺和肩胛區[3]。棕色脂肪組織和白色脂肪組織在形態和功能上完全不同。白色脂肪組織是儲存過剩能量的主要組織，有較少的線粒體和大脂滴，能將體內過多的能量以甘油三酯的形式儲存起來，當能量缺乏時，水解為游離脂肪酸釋放入血循環，以供產能。棕色脂肪組織是一種耗能組織，有更多的線粒體和小脂滴，其線粒體富含解偶聯蛋白1(Uncoupling protein 1, UCP1)，可以跨過線粒體內膜運輸質子，破壞氧化磷酸化，而機體對ATP的需求迫使更多脂肪分解，實現非顫抖性產熱[4-6]。近期研究發現，在寒冷、運動刺激或β3腎上腺素受體激動劑作用下，可以促進UCP1和過氧化物酶體增殖物活化受體γ協同刺激因子1α(Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)等產熱基因的表達，并且白色脂肪組織中UCP1陽性脂肪細胞數量會明顯增加，并發揮類似于棕色脂肪的產熱作用，其被稱為“米色脂肪細胞”(Beige adipocyte)[7]。米色脂肪細胞可以增加能量代謝，產生減肥效應，并由于米色脂肪細胞來源于白色脂肪細胞的轉化，因此將這一過程稱為白色脂肪棕色化[8-11]。而熱中性環境可以使棕色脂肪失活，向白色脂肪轉變[12]。

Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一類含鋅指的轉錄因子，可調節細胞增殖、分化、發育和程序性死亡。其功能的改變與許多人類疾病的病理生物學有關，包括心血管疾病、代謝紊亂和癌癥[13]。KLF7對包括瘦素在內的多種脂肪細胞因子的表達有抑制作用，并且是哺乳動物脂肪細胞分化的負調控因子，基因多態性和關聯分析顯示，KLF7還是糖尿病和肥胖癥的相關基因[14-16]。而KLF7是否在白色脂肪棕色化過程發揮作用尚未見文獻報道。

為此，本實驗以C57BL/6小鼠為研究對象，通過高脂飲食誘導建立肥胖小鼠模型，觀察白色脂肪棕色化過程中棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織中KLF7蛋白表達情況，為深入揭示KLF7的調控功能和生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選擇4周齡C57BL/6雄性小鼠36只，購自賽業(廣州)生物科技有限公司，飼養于石河子大學醫學院實驗動物中心。適應性喂養一周后，將小鼠按體重隨機分為普通飲食組(normal diet, ND)(n=6)和高脂飲食組(high-fat diet, HFD)(n=30)。分組喂養8周成功構建飲食誘導的肥胖模型后，將高質飲食組小鼠隨機分為室溫組(n=6)、4 ℃冷刺激處理組(n=6)、32 ℃熱中性處理組(n=6)、生理鹽水處理組(Saline)(n=6)和β3腎上腺素能受體激動劑處理組(CL316,243)(n=6)。本研究經石河子大學醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審批(編號：A2019-086-01)。

1.2 小鼠肥胖模型的建立

2組C57BL/6小鼠均分籠喂養，普通飲食組飼以基礎飼料(江蘇美迪森生物醫藥有限公司提供)，高脂飲食組飼以高脂飼料(60%脂肪)。每天更換飲用水，隔日清理糞便，每天監測小鼠飲食量、每周測量小鼠體長和體重1次。

1.3 實驗儀器

電子分析天平(中國賽多利斯公司)、動物恒溫培養箱、Western blot電泳儀(Bio-Rad公司)、高速冷凍離心機(Thermo公司)、超低溫冰箱(Thermo公司)、血糖儀(瑞士羅氏公司)。

1.4 實驗試劑

CL316,243、UCP1抗體、PGC-1α抗體和KLF7抗體購于Abcam公司，β-Tubulin抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司, 生理鹽水(saline)購于新疆華世丹藥業股份有限公司。

1.5 方法

1.5.1 給藥方法及劑量

室溫組小鼠置于25 ℃環境7 d，4 ℃冷刺激處理組小鼠置于4 ℃環境7 d，32 ℃熱中性處理組小鼠置于32 ℃動物飼養恒溫箱7 d，β3腎上腺素能受體激動劑處理組每日按照1 mg·kg-1腹腔注射β3腎上腺上腺素能受體激動劑CL316,243 處理7 d, 生理鹽水處理組小鼠每日腹腔注射等量生理鹽水。

1.5.2 攝入量的測定

當日稱量加入小鼠飼料重量，次日同時稱量剩余飼料重量，通過計算，得出小鼠每日的食物攝入量。

1.5.3 樣本收集

處理7 d結束后，解剖分離小鼠棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織并稱重，將脂肪組織迅速放入-80 ℃冰箱凍存，用于后續測定KLF7蛋白表達水平。

1.6 數據處理

應用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，所有計量數據首先需進行正態性檢驗，符合正態分布的數據選擇獨立樣本t檢驗(均數±標準差)，不符合正態分布的數據選擇非參數秩和檢驗(數據以中位數呈現，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體重比較

如圖1所示，分組喂養8周后，高脂飲食組小鼠體重顯著高于普通飲食組，差異有統計學意義(P<0.001)。

圖1 普通飲食組(ND)與高脂飲食組(HFD)小鼠體重(A)和大體形態(B)比較

2.2 棕色化和白色化條件對小鼠體重、攝食量和血糖的影響

如圖2所示，不同處理組小鼠各自處理7 d后，通過對小鼠體重稱量發現，與對照組相比，β3腎上腺素能受體激動劑處理組和32 ℃熱中性處理組沒有差異顯著性，而4 ℃冷刺激組小鼠體重顯著降低，并且血糖顯著升高。與對照組相比，β3腎上腺素能受體激動劑處理組和4 ℃冷刺激組小鼠攝食量沒有差異顯著性，而32 ℃熱中性處理組小鼠攝食量顯著減少。

圖2 棕色化和白色化條件對小鼠體重體重(A)、血糖(B)和攝食量(C)的影響

2.3 棕色化和白色化條件對小鼠脂肪組織重量和形態的影響

如圖3所示，通過完整的分離棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織，并進行稱量計算后發現，與對照組相比，β3腎上腺素能受體激動劑處理組和32 ℃熱中性處理組小鼠附睪白色脂肪組織重量顯著降低，4 ℃冷刺激處理組小鼠棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織重量均顯著降低。

隨后與對照組相比，β3腎上腺素能受體激動劑和4 ℃冷刺激處理可使小鼠棕色脂肪組織顏色更深。

圖3 棕色化和白色化條件對小鼠3種脂肪組織重量(A)和形態(B)的影響

2.4 3種脂肪組織中KLF7蛋白表達水平差異

如圖4所示，完整分離對照組小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進行Western blot檢測，發現PGC-1α、UCP1和KLF7的蛋白含量在棕色組織組織中含量最高。

2.5 高脂飲食與普通飲食小鼠脂肪組織中KLF7表達差異

如圖5所示，高脂飲食喂養八周后，完整分離高脂飲食和普通飲食組小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進行Western blot檢測，發現普通飲食組小鼠的棕色脂肪組織和腹股溝白色脂肪組織中PGC-1α和UCP1含量升高，而高脂飲食組小鼠的棕色脂肪組織和腹股溝白色脂肪組織中KLF7含量升高。

圖4 小鼠棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織中KLF7蛋白表達水平

圖5 高脂飲食與普通飲食小鼠棕色脂肪組織(A)、腹股溝白色脂肪組織(B)和附睪白色脂肪組織(C)中KLF7蛋白表達差異

2.6 β3腎上腺素能受體激動劑處理對小鼠脂肪組織中KLF7表達的影響

如圖6所示，完整分離對照組和CL316，243處理小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進行Western blot檢測，發現UCP1和KLF7會因β3腎上腺素能受體激動劑處理而升高。

圖6 β3腎上腺素能受體激動劑對高脂飲食小鼠棕色脂肪組織(A)、腹股溝白色脂肪組織(B)和附睪白色脂肪組織(C)中KLF7表達的影響

2.7 4 ℃冷刺激和32 ℃熱中性處理對小鼠脂肪組織中KLF7表達的影響

如圖7所示，完整的分離室溫處理組、4 ℃冷刺激處理組和32 ℃熱中性處理組小鼠的棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織進行Western blot檢測，發現與室溫組小鼠相比，UCP1、PGC-1α和KLF7會因4 ℃冷刺激而升高，而32 ℃熱中性條件下會使UCP1、PGC-1α和KLF7降低。

圖7 4 ℃冷刺激和32 ℃熱中性條件下對高脂飲食小鼠棕色脂肪組織(A)、腹股溝白色脂肪組織(B)和附睪白色脂肪組織(C)中KLF7表達的影響

3 討論

肥胖源于能量攝入和能量消耗之間的長期不平衡，并且與心血管疾病、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等疾病密切相關[17]。白色脂肪組織可儲存多余的能量，棕色和米色脂肪組織可以產熱，并以熱量的形式消耗能量。已有研究表明，成年人中存在活躍的棕色脂肪組織，并且其與較低的體重指數(BMI)、較低的年齡、較低的室外溫度、女性性別和較低的血糖水平有關[18]。因此，促進白色脂肪棕色化對于治療肥胖及相關代謝性疾病具有廣闊的應用前景。

轉錄因子KLF7 具有核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)，能夠與入核載體結合，通過核孔復合體運送至細胞核。KLF7 蛋白羧基端具有保守的 3 個 C2H2 型鋅指結構域[19]，可以結合靶 DNA 的 CACCC 基序或富含 GC 的序列，調控靶基因表達[20]。KLF7在脂肪、胰腺、肝臟和骨骼等組織均表達。已有研究表明，KLF7在胰島β細胞中抑制胰島素的表達和釋放；在脂肪細胞中能夠抑制脂聯素和瘦素的合成，促進炎癥因子IL-6的釋放[16]。并且KLF7還是是哺乳動物脂肪細胞分化的負調控因子，KLF7的表達在3T3-L1脂肪細胞分化時降低，并且KLF7過表達會抑制脂肪生成。類似地，KLF7在人前脂肪細胞中的過表達會抑制了其向脂肪細胞的分化，并降低了脂肪生成相關基因的表達[13]。本研究的結果顯示，棕色化條件下如β3腎上腺素能受體激動劑處理和4 ℃冷刺激處理可在不改變小鼠飲食量情況下，其棕色脂肪組織、腹股溝白色脂肪組織和附睪白色脂肪組織的重量均呈降低趨勢，并且促進KLF7的表達增加，與UCP1呈同步變化，提示KLF7可能在白色脂肪棕色化過程發揮抑制脂肪細胞分化和脂肪合成的作用，同時KLF7作為一個轉錄因子是否能轉錄激活UCP1有待進一步研究。