埃希氏菌的遺傳演化關系分析

劉俊華，周憶蓮，崔垚鑫，劉燕霏，楊建德

（天津農學院 動物科學與動物醫學學院，天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300392）

埃希氏菌（Escherichia）是重要的人畜共患病病原菌，目前已知有七個物種，分別是大腸埃希氏菌（CASTELLANI&CHALMERS，1919）、赫爾曼埃希氏菌、傷口埃希氏菌（BRENNER等，1982）、弗格森埃希氏菌（FARMER等，1985）、蟑螂埃希氏菌、艾伯特埃希氏菌（HUYS等，2003）以及從中國青藏高原旱獺糞便中發現和命名的旱獺埃希氏菌[1-3]。大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌，有一部分血清型常引起幼齡動物發生嚴重腹瀉和敗血癥等疾病，且這類具致病性的大腸桿菌能在不同種動物之間進行傳播[4-6]。赫爾曼埃希氏菌是條件性致病菌，可引起人的原發和繼發性感染，如呼吸道、泌尿系統感染及傷口化膿性感染等[7]。弗格森埃希氏菌是對人類少見的條件致病菌，可引起人和動物創傷感染、尿道感染、菌血癥、腹瀉和胸膜感染等[8-11]。艾伯特埃希氏菌在一處人類病例中導致患病者出現血性/非血性腹瀉、 嘔吐、脫水、發熱、腹脹等臨床癥狀，是一種重要的潛在新發食源性致病菌[12]。蟑螂埃希氏菌、旱獺埃希氏菌經查閱現有資料未得到具體臨床癥狀信息。埃希氏菌在致病性上或多或少誘發人畜表現出相同或相似的臨床癥狀，同時又致人畜表現出其他完全不同的臨床癥狀，使疾病防治難度加大。

16S rRNA是所有原核生物蛋白質合成必需的1種核糖體RNA，大約由1 550個核苷酸組成，其長度能夠表現足夠的種間多態性，又便于序列分析[12]。細菌基因組中16S rRNA在漫長進化中表現出高度保守性，有微生物“化石”之稱。它的結構中保守區域與變異區域共存，形成了不同微生物的特征核苷酸序列，是較好的生物標志物，可作為微生物多樣性分析的分子基礎，用來鑒定細菌的進化距離和親緣關系。2005年，基于焦磷酸測序法的高通量測序系統為測序技術帶來革命性進步，16S rRNA數據庫得到迅速擴大[11]。本試驗通過對實驗室分離菌及 NCBI數據庫檢索的多種埃希氏菌菌株的16S rRNA進行篩選、整理，經同源序列比對分析構建分子進化樹，探究不同地區埃希氏菌的進化與遺傳演化關系，揭示埃希氏菌在畜禽疾病傳播與突變中的遺傳進化規律，為防治該病提供理論參考依據。

1 材料

在本實驗室培養并分離出4株菌株，GenBank序列號分別為MK729003.1（E. coli1 106，1 481 bp）、MK729001.1（E. fergusoniijoe，1 483 bp）、MK729002.1（E. coli1 018，1 475 bp）、MK685226.1（E. marmotaeEy-zq，1 480 bp）。其余16S rRNA序列均來自美國國立生物技術信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI），進入NCBI主頁（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）選擇需要的序列進行下載。

BioEditv7.0.5軟件下載自 http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html，MEGA X軟件下載自https://www.megasoftware.net，DNASTAR軟件下載自https://www.dnastar.com。

2 方法

2.1 基因序列篩選

在 NCBI網站搜索框中，通過 Nucleotide BLAST將實驗室分離的 4組基因序列分別運行BLAST比對，檢索NCBI數據庫中16S rRNA序列。本試驗以埃希氏菌屬16S rRNA作為研究范圍，探究不同地區埃希氏菌的進化與遺傳演化關系。試驗排除了序列檢索到的非埃希氏菌基因序列信息，而選擇BLAST比對結果中同源相似性較高、序列一致性在95%以上的序列[12-13]。同時檢索其他未進行比對的埃希氏菌16S rRNA序列，以此擴大試驗菌株的地域范圍及菌株多樣性。對這些序列進行下載，在 NCBI中收集序列信息，包括 GenBank序列號、菌株編號、序列來源地區、序列長度，整理數據。

2.2 基因同源性比較及分子進化樹構建

2.2.1 使用BioEdit軟件對基因序列進行處理

打開 BioEdit軟件運用 ClustalW Multiple alignment方法對42個基因序列進行整合、比對、分析，得到長度約為1 100～1 483 bp之間的基因序列。

2.2.2 基因同源性比較

打開 DNASTAR軟件導入已做處理序列，進行基因同源性比較。

2.2.3 利用MEGA X軟件構建分子進化樹

在 MEGA軟件中，用 Neighbor-Joining（NJ，鄰接法）和 p-distance模型按照軟件原始參數構建分子進化樹使已經修剪對齊的 16S rRNA基因序列生成鄰接樹，估計它可以引導支持運行100 000次重復檢測[13-14]。同時采用Bootstrap法進行Bootstrap values（步長值）為1 000的重排構樹檢驗所計算的進化樹各分支的可信度，估計 95%的可信限度，完成分子進化樹構建[15]。

3 結果與分析

3.1 基因篩選

基于16S rDNA序列（16S rRNA基因）分析是細菌系統分類的“金標準”[16]，在NCBI數據庫中分別以 MK729003.1、MK729001.1、MK729002.1、MK68526作為目的基因進行搜索，通過BLAST中的Nucleotide BLAST選項，共得到400個部分重復的基因序列，同時在NCBI總數據庫中搜索得到100個埃希氏菌16S rRNA基因序列，經過進一步篩選，得到42個來源明確、長度適中的埃希氏菌16S rRNA基因序列，見表1。

表1 埃希氏菌屬16S rRNA基因序列信息

3.2 基因同源性比較及分子進化樹構建

根據表1數據，運用DNASTAR、MEGA X軟件進行同源性比較和序列比對，用鄰接法構建鄰接分子進化樹，見圖1。

圖1 42株埃希氏菌株分子進化樹分析

由圖1可以看出，所有菌株根據在進化樹中的分布可以分為四大分支：大腸埃希氏菌與弗格森埃希氏菌集中分布一支，艾伯特埃希氏菌、旱獺埃希氏菌及傷口埃希氏菌分成三支且各自獨立集中分布。四大分支遺傳距離遠近呈現有序的狀態，總體來看，旱獺埃希氏菌分支在進化樹中結點最為靠前，其后依次是大腸埃希氏菌、弗格森埃希氏菌、艾伯特埃希氏菌、傷口埃希氏菌。傷口埃希氏菌絕大多數與其他四種菌處于完全不同的一支上，同源性僅在 94.0%左右。同時在大腸埃希氏菌、弗格森埃希氏菌、艾伯特埃希氏菌、旱獺埃希氏菌中，或多或少的有某些菌株交叉在一起，同源性在 96.0%左右，如 HQ259947.1E.vulnerisM3 （China）遠離本菌群分支靠近旱獺埃希氏菌分支，與MF682954.1（Korea）同源性98.8%，與MK685226.1（China）同源性99.6%，另外大腸埃希氏菌與弗格森埃希氏菌完全混雜在一起，大部分菌株同源性高達 98.0%。這反映出四大分支菌的基因同源性大小和親緣關系的遠近，也反映出菌株之間存在著程度不同變異，且不同類種菌株間相互變異度不同，推測大腸埃希氏菌和弗格森埃希氏菌之間變異度最高，其余分支在菌種之間變異較低，存在較高保守性[16-18]。

在進化樹中，每一大分支中多數菌株支長存在較小差異，且有著非常明顯的地域特征。這些基因序列在較小的距離內發散，最終聚類到一起，且各類聚合支之間的地域特征非常明顯[19]。

3.2.1 大腸埃希氏菌和弗格森埃希氏菌共同進化

大腸埃希氏菌和弗格森埃希氏菌混雜在一起，它們的遺傳距離較近，如 NR 114042.1E. coliNBRC 102203 （Japan）與 KJ726590.1E. fergusoniiGen8 （U.S.A）的同源性高達98.9%，MK729003.1E. coli1106 （China）與 KC986847.1E. fergusoniiBI03 （New Zealand）、KC986857.1E. fergusoniiBI13 （New Zealand）、MK729001.1E. fergusoniijoe（China）的同源性分別為99.3%、99.1%、100.0%。另外，KJ626264.1E. fergusoniiE10 （Netherlands）與MK729002.1E. coli1018（China）分支相距較遠，但這兩種不同菌種菌株的同源性高達 99.4%。由此推測兩種菌在很早的時期是由共同的原始菌株演化而來，且兩種菌之間發生變異而相互轉化的可能性也極高[19]。在圖 1 中，KF938590.1（Korea）、KJ806495.1（China）與 KJ626246.1（Netherlands）聚為一支，KC986847.1（New Zealand）與KC986857.1（New Zealand）、MK729001.1（China）、MK729003.1（China）聚為一支，這兩支同源性高、遺傳距離較近，且前一支結點靠前，推測弗格森埃希氏菌可能在跨區域傳播過程中發生變異形成新的本菌群菌株，部分菌株變異成大腸埃希氏菌屬[17-18]。

3.2.2 艾伯特埃希氏菌單獨進化

由圖1也可以看出在艾伯特埃希氏菌中，來自南極的KF891382.1（Antarctica）和KF891381.1（Antarctica）兩株聚類到一支，同源性高達98.2%；來自中國的KX765467.1 （China）遠離KX765475.1（China）且與之同源性高達 99.8%，兩株菌株都遠離來自日本的AB594160.1 （Japan），卻與南極的兩株聚類到一個結點，同源性分別為 97.9%、96.8%、97.7%、96.6%；同時KX765475.1（China）與 KT333052.1（Australia）聚類為一支，同源性高達 99.2%。由此可以推測，該菌型在同一地區存在高度保守菌株與保守性較低菌株共存的情況，且在亞洲與大洋洲、南極洲三大洲間存在著交叉進化。

3.2.3 旱獺埃希氏菌兩枝進化，與傷口埃希氏菌關系較為密切

在圖1中，可以發現一個明顯的中國地區旱獺埃希氏菌聚集，KP263376.1 （China）、KP263379.1（China）、NR 136472.1（China）、KP263378.1（China）四株構成了進化較近的中國基因型，呈現一種獨立的進化分支，并遠離其他分支，說明旱獺埃希氏菌在我國存在特有的菌型，其具有高度的保守性，但從圖中仍能夠發現另一株MK68526（China）不在本分支內，體現出中國旱獺埃希氏菌分支的存在。從圖中還能發現MF682954.1（Korea）、MK68526 （China）、MH021660.1（India）、MF480443.1（Korea）聚類到一支，相互遺傳距離較近，且共同的結點位于中國地區旱獺埃希氏菌聚集分支結點前，推測中國地區旱獺埃希氏菌是由該分支進化而來。同時發現，出現的菌株全部為亞洲大陸的，沒有發現其他大陸地區的蹤跡，說明旱獺埃希氏菌更適宜生存的地區可能在亞洲大陸，且可能是旱獺埃希氏菌的發源地[17-20]。

由圖 1還可以發現，在傷口埃希氏菌中，MF079358.1（China）、KX357823.1（India）、LT631770.1（Belgium）、LC040946.1（Pakistan）、AB681776.1（Japan）、JQ958880.1（France）、KR612005.1（India）、AF530476.1（Canada）在地域距離上相隔較遠，彼此間遺傳距離較大，但最終聚類為一支。從圖中可以明顯發現，分支產生的順序在地理位置上有著一定的規律：東亞、南亞、西亞、歐洲、北美洲，說明傷口埃希氏菌的傳播可能發源于亞洲，并且在傳播過程中不斷發生不同程度變異。

4 討論

42株菌株分為四大分支[21]，不同分支間集中分布明顯，說明四個分支間存在較高保守性，且不同菌屬可能朝著不同的方向進化[19]。大腸埃希氏菌與弗格森埃希氏菌分布為一支，相互之間同源性高，遺傳距離近，與其他菌型親緣關系較遠，在共同進化中易發生變異，如 KF938590.1（Korea）、KJ806495.1（China）、KC986857.1（New Zealand）、MK729003.1（China）、NR 114042.1（Japan）、KJ726590.1（U.S.A），其進化程度與地理位置關系不大。在艾伯特埃希氏菌中，來自南極洲的兩株在遺傳關系上距離較近，同源性高達98.2%，來自中國的兩株在遺傳關系上距離卻較遠，表明艾伯特埃希氏菌的類型與生存環境條件有很大關聯性，該菌型進化方向仍未突破地域，而基于16S rRNA序列分析，推測艾伯特埃希氏菌的起源可能是多源的，環境條件可能作為重要的進化壓力，在艾伯特埃希氏菌長期演化過程中扮演重要角色[19]；另外，來自中國的一株與南極的兩株在遺傳關系上距離較近，另一株中國的與來自澳大利亞的一株在遺傳關系上距離較近，說明該菌型在亞洲與大洋洲、南極洲三大洲間可能存在著交叉進化。

在進化樹上，4 株中國基因型旱獺埃希氏菌菌株與其他不同地區菌株分離明顯，各自獨立進化，且它們全部位于亞洲大陸，可以推測旱獺埃希氏菌更適宜生存的地區在亞洲大陸，研究中國此類菌株更有利于揭示旱獺埃希氏菌基因的遺傳進化規律，傷口埃希氏菌在地域距離上相隔較遠且株間分布較散，可能與傷口埃希氏菌極易感染傷口的特性有關[17-21]。

在同源性比較與分子進化樹中，也有一些菌株散落在不同菌種的分支間，并且與周邊菌株的同源性極高，除了基因變異，推測是由于一些特殊因素造成細菌傳播，如人口流動、物種引進、候鳥遷徙、人工養殖和商貿交流。在進化樹的分支中，接壤國家之間的菌株同源性相對較高，說明埃希氏菌在陸地之間傳播的可能性更高，但是不接壤國家間也存在同源性極高的菌株，不排除埃希氏菌間接傳播的可能。本研究在國內首先開展埃希氏菌屬遺傳演化關系分析，從分子水平闡明各個菌株流行分布規律，為更好預防埃希氏菌病傳播提供理論依據。