獼猴桃抗菌肽截短體原核表達載體的構建

李 蒙

(西安文理學院 生物與環境工程學院，西安 710065)

由于一直以來傳統抗生素的過度使用，已經引起細菌耐藥性發生改變，從而在世界范圍內引起嚴重的健康問題，尋找新型有效抗菌藥物變得越來越重要.動植物等生物類抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)是一類具有抗菌活性的低分子量短肽，大多數是由陽離子和疏水性殘基組成的雙親性分子[1].其能快速且有效地對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、絲狀真菌和原生生物以及包膜病毒在內的微生物起到殺傷效果，因此被稱為“自然抗生素”[2].大多數抗菌肽是通過靜電作用和疏水作用吸附于細菌的細胞膜，破壞膜結構使其內容物外漏，發揮殺菌活性，抗菌肽獨特的作用機制使細菌很難通過改變細胞膜成分對其產生抗藥性[3]，因此，抗菌肽也被稱為天然防腐劑，可以抑制致病菌的繁殖，且其自身熱穩定性好，安全無毒害，在食品工業中其防腐和保鮮方面具有廣闊的應用前景[4].

近些年來，獼猴桃市場前景可期，但也存在一些問題.獼猴桃成熟與采摘過程中病蟲害等外部因素，導致損失率大，現在部分針對獼猴桃潰瘍病、軟腐病、褐斑病等病害的防治技術[5-7]以化學防治為主，防治效果有限，并會產生部分化學藥品殘留，潛在影響獼猴桃果實的品質.目前在食品工業中抗菌肽中乳鐵蛋白、蛙皮素、乳酸鏈球菌素(Nisin)等已被廣泛應用于防腐保鮮領域，Nisin可抑制乳酸菌、腸炎沙門氏菌、大腸桿菌等的生長，在肉和雞蛋類食品中有良好的防腐保鮮效果[8-10].開發環保無公害、成本合理、操作方便等優點的天然防腐保鮮劑，是抗菌肽研究工作的重點.

圍繞陜西省“十四五”科技發展規劃部署的重點任務和產業重大科技需求，聚焦解決“卡脖子”問題，開展獼猴桃病蟲害防治、收儲加工運輸環節中保鮮劑的研發與應用，本實驗室前期已經構建了pET-47b(+)-Fa-AMP抗菌肽原核表達載體[11]，在此基礎上，本研究擬通過基因重組技術獲得pET-47b(+)-Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽的重組載體及原核表達菌株，為后續抗菌肽在果蔬保鮮方面的功能研究奠定基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

原核表達載體pET-47b(+)-Fa-AMP、大腸桿菌BL21(DE3)pLysS和DH5α均由本實驗室保存.

1.2 試劑

BamH I和SacⅡ核酸限制性內切酶，DNA分子量 Marker；Taq PCR Mastermix；DNA純化試劑盒；質粒提取試劑盒.

1.3 抗菌肽基因設計及合成

根據NCBI數據庫中抗菌肽(accessionPSS14603.1)蛋白質序列分析，截取93個氨基酸進行密碼子優化及合成(上海生物工程有限公司)TrAMP核苷酸序列(5’-ATGTCTCTGCGTGGCAAACTGCCGCTGCTGGCTCTGCTGCTGGCTCTGGTTTTCGTTCTGG CTTCTGTTGCTTTCGGCGCTGCTGAATGGAACGACGGCAGCCCGGAAAAACGTCTGCGTGAATGCCAGCAGCGTTGCGACCGTCACGAACAGCGTGAAGAACGTGAAGACTGCCAGCGTCGTTGCCTGGAAGACTACCGTCGTGAAAAAGAAGAACGTGGCGGCCGTGCTGAAGAAATCACTCCGCACCACAAAGGCCGTGAAGAAGAAGAAAAAGAA-3’).

1.4 融合抗菌肽基因的表達載體構建

根據公司優化后合成的TrAMP核苷酸序列，設計擴增引物，利用Vector NTI軟件設計上下游引物F1(5’-ACTGCCGCGGGGATGTCTCTGCGTGGC AAACTG-3’，下劃線為SacⅡ酶切位點)，R1(5’-ACTCGGGATCCTTCTTTTTCTT CTTCTTCAC-3’，下劃線為BamH I酶切位點)引物，采用PCR法獲得目的基因.PCR反應體系(25 μL)：F1，R1引物各1 μL，2xTap酶 Mix 12.5 μL，ddH2O 17.5 μL，模板0.5 μL.PCR程序：94 ℃預變性1 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環30次；72 ℃終延伸10 min.反應結束后使用1.0 %瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，產物使用純化試劑盒進行純化后置于-20 ℃保存.使用核酸限制性內切酶對純化的PCR產物和原核表達質粒pET-47b(+)進行雙酶切，酶切后構建重組真核表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，通過pET-47b(+)載體通用引物T7上游引物(5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’)，T7下游引物(5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’)對Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽基因擴增驗證，PCR反應體系(25 μL)、程序和檢測方法同目的基因方法相同.

1.5 序列比對分析及抗菌活性預測

利用ExPASy在線進行蛋白質等電點及分子量預測(https://web.expasy.org/protparam/)；在NCBI數據庫中進行BLASTP序列比對；二級結構預測采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html)；空間結構預測采用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive).抗菌活性預測在數據庫DBAASP(https://dbaasp.org/tools?page=special-prediction)中進行分析.

2 實驗結果與分析

2.1 融合抗菌肽基因的克隆與載體構建

對截短體抗菌肽TrAMP基因的PCR擴增產物，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行DNA電泳分析，由圖1可見，250～500 bp間有特異性條帶，符合預期結果，再將其連接到表達載體pET-47b(+)-Fa-AMP中，載體上通用引物PCR擴增鑒定，結果表明與實驗預期的Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽基因大小一致，測序表明融合抗菌肽的原核表達載體構建成功.

圖1 抗菌肽基因的PCR擴增

M.DL2000.1、2、3、7、8、9.Fa-AMP基因的PCR擴增結果；4、5、10、11.Fa-AMP+TrAMP基因的PCR擴增結果；12、13、14.TrAMP基因的PCR擴增結果；0、6.雜帶.

2.2 生物信息學分析與抗菌活性預測

序列在NCBI數據庫中比對，結果顯示氨基酸序列一致，在線軟件預測融合抗菌肽分子量為16.368 kD，等電點為6.50，為不穩定蛋白，通過SOPMA對Fa-AMP+TrAMP融合抗菌肽進行二級結構預測，結果表明，其二級結構中α螺旋所占比例為47.95%，β轉角所占比例為8.22%，無規則卷曲所占比例為41.78%，延伸鏈所占比例為2.05%.說明其蛋白的二級結構以β折疊和無規則卷曲為主.利用在線ExpASy的SWISS-MODEL對其進行三級結構預測顯示是多肽的無規則卷曲.選取融合抗菌肽功能域的氨基酸序列對大腸埃希菌，銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等7種細菌進行活性預測，結果表明其對肺炎克雷伯菌有抑菌活性(表1).

表1 抗菌活性預測結果

注：陽性預測值(positive predictive value,PPV)表示預測為活性肽；陰性預測值(negative predictive value,NPV)表示為非活性肽.而對人紅細胞活性的評價，非活性肽被認為是陽性，以PPV表示).

3 討論

截至目前，多種抗菌多肽和蛋白質已經在不同生物中被發現并得到分離，數百種抗菌肽的結構已得到確定，抗菌肽數據庫也已經極大擴展[12-13]，抗菌肽基本上具有非特異性抗細菌、真菌、病毒等病原體的作用，并且幾乎抗菌肽沒有致畸作用且不發生蓄積中毒[14].抗菌肽分子量一般小于10 kD，由15～50個氨基酸殘基組成，多數含有較多正電荷氨基酸并且長度、序列和結構多樣的雙親性多肽，可以殺死革蘭氏陰性和陽性細菌、真菌、病毒及癌變的細胞[15].抗菌肽可以選擇作用于病原微生物，作用微生物時可以有多個靶標，從而減少耐藥性[16]，抗菌肽具有分子小、水溶性好、穩定性高等特點，在機體內最終被酶解為氨基酸，無殘留毒性，被作為新型抗菌劑應用于醫藥[17]、食品工業[18]等領域.

抗菌肽可以直接從微生物、植物和動物體中提取分離，但是直接提取對工藝要求高，難度大[19].因此，通過分子生物學技術合成人工抗菌肽是高效制備的理想選擇.因此，本實驗選取獼猴桃抗菌肽部分序列，其中包含預測的功能結構域(a-C-X-X-X-C-(10-12)X-C-X-X-X-C)序列，進行基因合成與載體重組，成功構建了表達載體pET-47b+Fa-AMP+TrAMP，并通過生物信息學模型預測顯示融合抗菌肽具有抑菌活性，為抗菌肽的高效制備及其結構與生物活性功能的研究奠定了基礎.

對于AMP及其生物功能預測有助于了解其作用機理，為開發設計更有效與穩定的活性抗菌肽提供理論依據.目前經驗分析優化抗菌肽方法是通過蛋白質序列、理化性質、抗菌性及溶血性等參數分析及進行分子設計，通過計算機構建抗菌肽模型，挖掘生化特性與抗菌活性之間的線性與非線性關系，都是基于抗菌肽序列優化與生化特性研究[20-22]，其存在諸多不足，比如優化后的抗菌肽不穩定、易降解、制備難度大、抑菌效果差等，亟待進行大量試驗進行驗證與分析.本研究通過兩種抗菌肽序列的重組，優化抗菌肽技術路線，有助于特定情況下有針對性地改變氨基酸殘基、調節疏水性、重塑構象和多肽柔韌性，為抗菌肽改造與應用提供合理選擇的方案和理論支持.