全谷物飲品穩定性的多尺度表征方法

姜 平，劉 明，康子悅，田曉紅，劉艷香，譚 斌?

（1. 國家糧食和物資儲備局科學研究院 糧油加工研究所，北京 100037）

（2. 哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

全谷物含有豐富的人體必需營養素、多種微量礦物質及多酚、γ-谷維素、燕麥蒽酰胺等抗氧化活性成分[1]，具有非常高的營養價值，常見的全谷物種類主要包括稻米、小麥、玉米、大麥、燕麥、莜麥、青稞、高粱、小米、黍米、薏苡、菰米、蕎麥、藜麥、籽粒莧等。全谷物食品（Whole grain foods）是指含有全谷物原料，且全谷物含量不低于50%的食品。近三十多年來的研究結果表明，更多的攝入全谷物可以降低人們對許多疾?。ㄈ缰酗L、Ⅱ型糖尿病、心臟疾病等）的患病危險[2]，同時還有利于預防胃腸癌癥和體重控制[3-5]，其健康功效已成為國際學術界的共識。全谷物飲品（Whole grain drinks）是指以全谷物為主要原料，且全谷物含量達到規定比例的，經加工調配制成的飲品[6]。由于全谷物飲品的出現，一定程度上減少了奶制品的消費，保護了動物權益，在道德倫理、健康和環境等方面產生積極效應，最近受到公眾越來越多的關注[7]。目前有各種各樣的谷物被用來加工成飲品，如大米、燕麥、藜麥、小米、玉米等，而以燕麥為基礎研發的產品是最近各企業和科研學者們關注的重點。Markets and Markets預測，從2020年開始，植物性飲品的復合年增長率為 11%，到 2025年將達到367億美元[8]，我國2020年植物蛋白飲料市場規模達 2 583億元，占飲料行業的比重繼續上升至24.2%，發展速度迅猛。

全谷物飲品不同于植物性飲品產品（如大豆飲品），植物性飲品多是主要以蛋白質和油體組成的乳狀液或懸浮液，而全谷物飲品是一種以水為連續相，以淀粉、膳食纖維、蛋白質、脂肪等為分散相的多相濁狀液分散體系，是一種熱力學不穩定體系，有一定的動力穩定性[9]。由于全谷物飲品體系中淀粉及膳食纖維含量高，具有多分散的粒徑分布，這就導致其分離速度快，貯藏期間會出現析水、沉淀、浮油、絮集等表觀不穩定現象，感官品質下降，嚴重影響消費者的可接受度[10]。全谷物飲品在穩定性方面的質量差異很大，這不僅取決于所使用原料的特性，還取決于所使用的配方和加工工藝[9]，目前研究學者多使用酶解、發酵、超細微粉碎等前處理方法及水膠體作為增稠劑等方法以提高全谷物飲品的穩定性[11-14]，提高消費者對全谷物飲品的接受度。

近年來，隨著人們對全谷物健康認知的提升，全谷物食品的關注度逐年提高，全谷物食品呈現出快速發展的趨勢，全谷物飲品作為其重要分支，非常有必要對其進行深入研究。目前全谷物飲品面臨的主要挑戰就是產品的穩定性，因此，必須系統完整地描述體系的穩定性特征以對產品獲得更好的理解和控制，這反過來將促進更好品質的產品開發，提高消費者接受度。本綜述旨在總結多尺度研究表征全谷物飲品穩定性的方法，包括一些經典方法以及新型的方法，期望能為全谷物飲品的開發提供方法指導，助力全谷物食品的快速發展，切實提高我國糧食資源可食化利用率，實施節糧減損，降低碳排放，提升國民健康水平。

1 多尺度科學內涵

“多尺度”是來源于現代物理學的一個多用于描述空間層次的概念，它可以分為宏觀、介觀、微觀和納觀四個尺度，而在食品體系中的多尺度還可以表現為空間、時間、濃度及因素等多尺度，如特征組分的空間尺寸大小、不同的反應時間、特征組分濃度的分布及動態變化以及食品加工過程中多種因素的耦合情況等。全谷物飲品穩定性的“空間多尺度”研究方法源自于物理學領域的常規設備，如：宏觀層面主要是采用基于超速離心原理的 Lumifuge穩定性分析儀及基于靜態多光散射原理的 Turbiscan Lab?穩定性分析儀和低場核磁共振技術（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）等來分析相分離程度；介觀層面主要有等光學顯微鏡、層析方法等；微觀層面主要有激光粒度儀、激光共聚焦顯微鏡、顯微成像、流變儀等；納觀層面主要有掃描電子顯微鏡、核磁共振及光譜設備等[15]，應用這些設備測定的數值、圖像、圖譜及建立的模型等也可以間接反映全谷物飲品“時間多尺度”穩定性、“濃度多尺度”穩定性及“因素多尺度”穩定性等。

在食品加工過程中，這些不同尺度實際上是相互交織、相互影響的[15]。目前，研究學者們對多分散全谷物飲品體系的穩定性主要從相分離（沉降系數等）的宏觀尺度、粒徑等介觀尺度、流變學界面特性等微觀尺度及原子層次等納觀尺度等多方面開展研究。

2 全谷物飲品的多尺度表征方法

全谷物飲品加工環節的許多因素都可能影響全谷物飲品的穩定性，它不僅受體系物理變異性（顆粒大小、zeta電位、產品的厚度等）的影響，而且受體系化學變異性（蛋白質、淀粉結構等）的影響，其物理穩定性是生物聚合物成分之間微妙平衡的結果[16-17]，具體體現在應用各種不同尺度研究技術對其在不同研究深度層面表征的各個方面（如圖1）。

圖1 多尺度表征全谷物飲品穩定性示意圖Fig.1 Schematic diagram of multiscale characterization of stability of whole grain drink

下表1列出了常用于表征谷物飲品系統穩定性的一些經典方法，這些方法從視覺、粒徑、電位、流變學、整體穩定性及蛋白質特性等方面進行分析，闡述不同加工方法或穩定劑的使用等手段對系統穩定性的影響[18]，每種方法在全谷物飲品中的應用各有利弊。

表1 谷物飲品穩定性表征的經典方法Table 1 Classical methods for grain beverage system characterization

2.1 宏觀尺度的表征方法

宏觀體系其實是由許多獨立的微元體組成的整體。全谷物飲品在放置一段時間后會出現析水、沉淀、浮油、絮集等表觀穩定性現象的變化，其相分離程度是宏觀穩定性的最直觀表達方式。傳統的相分離程度研究方法是瓶試法，此方法雖然簡單直觀，但耗時長，精確度較差[19]。在全谷物飲品這種顆粒尺寸較小的系統中，等待很長時間進行測量是不切實際的，可以使用離心機進行加速重力分離分析[20]，因此目前多采用 Turbiscan Lab?穩定性分析儀和 Lumifuge穩定性分析儀對不太透明的產品進行渾濁度測定。此方法采用脈沖近紅外光源對樣品（無需稀釋）透射光和散射光的強度隨時間變化的情況進行跟蹤測定，通過不同物質層對光的透射和散射之間的差異進而反映體系的相分離情況[21]。劉婷玉等[22]采用Turbiscan穩定性分析儀對儲存于 4 ℃條件下燕麥乳的穩定性進行測定，記錄了24 h內不穩定性指數（TSI）的變化情況，從而進一步解釋不同滅酶方式對燕麥乳穩定性的影響；陳若辰等[23]采用Lumifuge穩定性分析儀測定了不同高壓射流磨壓力對全組分燕麥漿穩定性的影響，隨著高壓射流磨處理壓力的增加，不穩定性指數越來越小，這表明全組分燕麥漿穩定性逐漸變好。這兩種方法可以準確快速的表征相分離程度，但對于透光性較差、黏度較大的樣品的測試結果還缺乏一定的準確性。

2.2 介觀尺度的表征方法

介觀尺度是介于納米和微米之間的衡量尺度。全谷物飲品分散相介觀顆粒粒徑隨時間的變化直接反映了體系中液滴的絮集過程，從而間接反映了宏觀尺度的相分離情況；而zeta電位可以表征體系中粒子的靜電行為，從而進一步反映全谷物飲品的穩定性，因此顆粒粒徑及zeta電位是全谷物飲品穩定性的重要指標。全谷物飲品顆粒粒徑的表征方法通常有顯微鏡法、光散射法及低場核磁共振技術；zeta電位通常采用動態光散射技術進行測定。

顆粒大小通常采用顯微鏡進行觀察，但SEM（掃描電鏡）和TEM（透射電鏡）需要樣本是低水分且導電的，因此并不適合觀察全谷物飲品系統的微觀結構[24]。激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）作為最近開發出的研究油水界面乳化性質的一種新方法，近年來被廣泛用來研究乳狀液或谷物飲品的液滴粒度[25-26]。CLSM法制備液體樣本的方法比較簡單，只需直接向液體樣本加入染料，快速混勻后滴加在玻片上直接進行上機觀察即可，無需脫水。該法通過將不同的分散相進行染色后，利用激光激發一定范圍內的光束使已染色的分散相液滴發出熒光，獲得了樣品內部不同物質的顆粒粒度及分散情況，結果更為直觀，不需稀釋即可提高圖像分辨率[27-29]。Li等[30]采用 CLSM 對全豆豆奶的微觀結構進行了分析，圖像清晰的反映了大部分油滴和蛋白質的形態、尺寸及分布狀態。CLSM法在全谷物飲品穩定性方面的應用具有原位測定、非接觸性、無破壞性的特點，而且可以對各組分（油脂、蛋白、淀粉、膳食纖維等）微觀精細結構變化進行觀察，進一步精準改進和調控加工，具有非常大的使用價值。

飲品系統的顆粒大小分布還可以使用靜態光散射技術來量化，如Mastersizer激光粒度儀，該方法利用粒子散射光的行為，通過輸入參數（折射率、吸收率等）測定可得到其粒度分布狀態圖譜及平均粒徑 Dx(50)、Dx(90)、D[4,3]、D[3,2]等結果。本文作者曾使用Mastersizer2000 E型激光粒度儀測定了凍融對紅豆濃漿顆粒粒度的影響[31]，但該方法測量時需要將樣品稀釋到一定程度，從而可能改變了樣品原有的微觀結構；另外對于不同產品類型的全谷物飲品需要使用不同的參數，結果可能無法進行比較。而 Turbiscan Lab?穩定性分析儀（此設備在 2.1中提到）則彌補了激光粒度儀的不足，它可以實現樣品無需稀釋的條件下對其粒度的直接測定[32]，從而實現對全谷物飲品顆粒粒徑的原位表征，但該方法耗時較長，而且對于透光性較差的樣品其測試準確性較差。

在本文 2.1中提到的用于分析相分離情況的低場核磁共振技術（LF-NMR）還能用于測定分散相的粒度特征。通過該技術測量懸浮液體系的馳豫時間，并計算固體顆粒的濕潤比表面積（可利用的吸附表面積），進而用來研究分散相顆粒在溶劑中的分散性及穩定性等。Yang等[33]應用LF-NMR對西蘭花泥的平均粒徑進行了分析，并基于比表面積及弛豫時間預測了其微觀結構模型。LF-NMR可以快速測定分散相粒徑分布，操作簡單，準確性好，且不受樣品顏色的影響，較Turbiscan穩定性分析儀而言，應用范圍更廣泛，推斷其是多相濁狀液分散體系粒度重要的原位研究方法，但 NMR序列參數選定困難，不適當的參數可能使結果出現較大偏差，在測試序列的選擇與優化上有巨大的發展空間。

Zeta電位通常采用動態光散射技術進行測定，該方法是基于帶電粒子在外加電場作用下的電泳運動，其電泳遷移率被轉化為zeta電位。通常zeta電位離零越遠，電泳穩定性越高；在zeta電位±30 mV時，可以實現適度的穩定性，在絕對值低于這一極限時，預計電斥力較弱并傾向于聚集，導致分離[34]。它受樣品組成、有機物的存在、稀釋介質的pH值和離子強度等因素的影響[14,16-17]，而且由于測試大顆粒樣品需要稀釋，因此這種方法被批評不能反映產品的實際情況，但它對系統穩定性的行為提供了額外的見解，仍被廣泛使用[35]。

2.3 微觀尺度的表征方法

從物理學角度來講，微觀層次的物質是具有波粒二象性的，因此微觀尺度的表征方法主要有流變特性、激光共聚焦顯微鏡等。

粘度是全谷物飲品發生相分離的物理屏障，流變特性主要是用流變儀分析樣品的表觀粘度，通過設置不同的剪切速率測定表觀粘度的變化情況，進而反映樣品不同的屬性，如重力流動、咀嚼吞咽流動和食道流動的剪切速率典型范圍分別為 0.1～10 s-1、10～100 s-1、10～1 000 s-1；觀察貨架穩定性及口感評價的剪切速率分別為10 s-1和100 s-1；添加水溶性膠體后粘度變化的穩定性等[9]。全谷物飲品是典型的非牛頓假塑性流體，流變學通過剪切應力或剪切速率掃描產生的流動曲線可以大致了解產品的流動特性，這一深入研究可以在粘度測定的基礎上進一步了解產品在加工、儲藏等環節的穩定性及感官特性；還可以確定穩定劑的最佳添加量[36]，該方法可用于指導全谷物飲品產品的研究開發。

激光共聚焦顯微鏡（CLSM）技術測定的基本原理已在本文2.2做過詳細介紹，在此不再贅述。該技術在全谷物飲品穩定性微觀尺度的分析主要是用于形貌結構的直接觀測。黃素君[26]采用CLSM清晰地觀測到不同高壓射流磨壓力制備的全燕麥漿中的蛋白體、油體微觀結構及疊加圖像，從微觀結構角度分析了影響其穩定性的潛在因素。

2.4 納觀尺度的表征方法

納觀尺度的表征對應原子層次的分析。全谷物飲品穩定性納觀尺度的表征方法主要有光譜設備、核磁共振及原子力顯微鏡等。

用于分析全谷物飲品穩定性的光譜學表征方法主要有拉曼光譜和熒光光譜。拉曼光譜（Raman spectroscopy）是一種能夠表征分子振動能級的光譜，具有極高的分子特異性，但其散射強度較弱，它的主要優點是不受水分子的干擾[37]，既能提供蛋白質、脂肪的空間結構信息，又對分子具有非破壞性，可用于二級結構以及側鏈等結構的分析[37-38]。拉曼光譜檢測特定的化學鍵，可以用來識別特定的分子及其結構，因此該方法可以用來分析表征與全谷物飲品穩定性相關的食品成分和食品添加劑[39]。熒光光譜有兩種主要類型：內在熒光光譜和外在熒光光譜。內在熒光光譜是指檢測樣品自身含有內源性熒光團，如蛋白質（可監測芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）、維生素（A、B6、E）、輔因子（NADH、FAD 和 FMN）、卟啉、葉綠素和一些核苷酸等；而外在熒光光譜是指向檢測樣品中添加外源性熒光團以標記特定的分子或結合物，使研究人員能夠跟蹤給定系統的特定屬性。由于蛋白質的展開與蛋白質的疏水性相關，因此監測全谷物飲品中蛋白質的疏水性可以進一步反映其乳化能力。全谷物飲品中蛋白質的疏水性既可以通過色氨酸的固有熒光來監測，也可以通過使用對蛋白質的疏水區域具有親和力的外部熒光探針如ANS（1-苯胺8-萘磺酸）和CPA（順式對萘酸）來監測[40]。熒光光譜法是在三級結構層面上來解析蛋白質的構象差異[41]、同時分析其空間微環境變化的一種方法[42]，也可作為淀粉的測試分析方法[43]。熒光光譜技術已被應用于許多食品體系，其在全谷物飲品的應用方面主要是監測加工對蛋白質展開的影響；另外使用熒光光譜可以跟蹤加熱過程中美拉德反應產生的中間產品或其他生物標志物產生的內在熒光團來監測調控熱處理程度[44-45]。

與光譜方法相比，核磁共振技術的靈敏度較低，但其得到的時域數據和光譜包含了大量關于樣品的物理和化學性質的信息。核磁共振儀器有兩類：高場核磁共振（high field nuclear magnetic resonance，HF-NMR）和低場核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR），其中LF-NMR不受樣品透光性的影響、測試精度較高，通過選取CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列和反轉恢復脈沖序列對樣品中油、水1H弛豫時間的差異分離出不同的信號，從而反映樣品相分離情況[46]。該方法已被廣泛用于觀察樣品在加工、儲存過程中的相變、基體和水的分布、流變學性質和成分變化等物理現象[47-49]。

原子力顯微鏡（AFM）是利用其彈性微懸臂前端納米級尖銳的微小探針與樣品表面之間產生相互作用力，通過激光光束照射微懸臂的形變情況，經光電二極管接收轉換成以圖像信息表征出來的分析儀器[50-51]。AFM技術對樣品的損壞程度低且對樣品導電性無要求，可以測試液態或水合狀態的樣品，分析可以達到分子級水平甚至原子級水平，具有高清晰度、高分辨率，細微結構特征探測等特點，因此已在食品大分子的組織結構（如多糖分子、蛋白質分子及其凝膠、結晶結構），表面微觀形貌和界面等方面得到廣泛的應用，是一種具有發展潛力和廣泛應用前景的顯微技術[52-53]。有研究學者應用 AFM 技術對乳及乳膠體的表面信息以及膠體結構情況進行了研究[54-55]，但由于乳是一種膠體體系，而全谷物飲品是一種多分散相的濁狀液分散體系，對于這種更復雜的、多相多組分的食品體系結構還需要將 AFM 技術結合其它手段進行分析。

3 影響全谷物飲品穩定性的特征化學組分的表征方法

全谷物飲品中的分散相主要是淀粉、膳食纖維、蛋白質、脂肪等，因此這些化學成分在含量、結構及功能等方面的變化也可以從某種程度上間接反映體系的穩定性情況。如全谷物飲品的淀粉老化是影響其穩定性的一個重要原因，因此對全谷物飲品中直鏈/支鏈淀粉含量、損傷淀粉含量以及淀粉結構的分析也是穩定性表征的一種間接方式[23]；在全谷物飲品體系中，蛋白質含量、蛋白質的功能性和溶解度等功能特性影響蛋白質穩定全谷物飲品體系的能力[56]；可溶性膳食纖維含量的變化[57]、淀粉、蛋白質、脂質等各成分含量的比例關系[58]等都是影響全谷物飲品體系穩定性的重要因素，但與物理特性的表征方法相比，化學特性的表征方法相對耗時長，對其結構等分析還需提取純化，測定程序較為繁瑣，但其作為物理穩定性的內在機制的調控依據研究還是具有重要意義的。

4 結語與展望

近年來，隨著全谷物健康認知和科學飲食概念的普及，消費者越來越關注形式各異的全谷物食品，全世界正掀起了一股全谷物食品的研發和消費風潮。我國《糧食節約行動方案》指出要“加快推進糧食加工環節節糧減損，提高糧油加工轉化率”，“啟動‘國家全谷物行動計劃’，開發全谷物原料質量穩定控制、食用品質改良、活性保持等技術，推進全谷物糧油加工技術開發和應用”。而全谷物飲品作為全谷物食品中的一種重要產品形式，其物理穩定性是研究開發過程中面臨的主要挑戰。本文主要總結了一些多尺度研究表征全谷物飲品穩定性的方法，期望能為從事全谷物飲品開發的工作者們提供一些思路，而對于全谷物飲品穩定性的研究方面，下一步關鍵還是要考慮如何系統性、綜合性、目標性地運用多尺度表征的技術方法，建立多種表征結果可以互相印證、互為因果、相互統一的穩定性研究體系，更為全面深入地探究全谷物飲品的穩定機制，以期更好地調控全谷物飲品加工各環節的影響因素，開發出更受消費者喜愛的全谷物飲品，助力我國全谷物食品的快速發展。