心肌細胞膜修飾的新型陽離子脂質納米顆粒介導心肌肥厚的高效治療研究

矯莉萍 李瑋 孫枝紅 劉杰 孫成銘*,

1（青島大學醫學部，青島266071）2（青島大學附屬煙臺毓璜頂醫院醫學檢驗科，煙臺 264000）

心肌肥厚是在血壓升高或后負荷增加時為了維持心臟正常的收縮功能而發生的生理適應性反應[1]。病理性心肌肥厚常與收縮功能障礙、間質纖維化、心臟結構重塑和胎兒心臟基因的重新表達相關聯，是誘發心力衰竭和猝死的重要原因之一[2-3]。目前，心肌肥厚的主要治療策略是藥物治療，即通過使用降低血壓或者能夠阻斷腎上腺素能受體的藥物[4]，但患者的臨床響應率低，治療效果并不理想。因此，亟需尋找一種能有效預防或者逆轉心肌肥厚的新型治療方式[5]。

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼的小RNA，以堿基互補配對的形式與靶基因3′非編碼區（3′UTR）識別和結合，通過對靶基因的切割或翻譯抑制而調控靶基因的表達[6]。miR-133a 是心肌組織中含量最豐富的miRNA 之一，在心血管疾病進程中具有重要作用[7]。研究發現，miR-133a 與心肌肥厚呈負相關[8]，主要通過抑制GDP-GTP 交換蛋白（RhoA）的表達來調控心肌肥厚的病理過程[8-10]。因此，miR-133a 具有治療心肌肥厚的應用潛力。

基于RNA 技術的基因治療（如mRNA、siRNA 和miRNA 等）通過調控相關基因的表達實現治療包括心血管病、腫瘤、遺傳病和免疫性疾病等多種疾病的目的[11]。為了實現有效治療，RNA 療法需將治療性的RNA 輸送至靶細胞中[12-13]。然而，RNA 在遞送的過程中面臨著多重阻礙，如RNA 表面負電荷和親水性阻礙了RNA 在跨質膜之間的被動擴散，并且易與血清蛋白結合而被吞噬細胞吞噬，體內血液循環中極易被RNA 酶降解等，均導致其難進入細胞中發揮功能[14]。為了克服上述阻礙，多種病毒類和非病毒遞送系統被開發用于RNA 的遞送。相較于病毒遞送系統，非病毒遞送系統可繞過病毒載體的限制，在不引起免疫反應的前提下將目標RNA 運送至靶細胞中發揮作用。

陽離子脂質納米顆粒（Lipid nanoparticles，LNPs）是目前應用最廣的非病毒類RNA 藥物遞送載體，通常由陽離子脂質、磷脂、膽固醇和聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）構成[15]。其中，陽離子脂質是通過與帶負電荷的核酸相互作用促進核酸包裹和介導內體破裂使核酸釋放到細胞質中，主要起到保護核酸免受核酸酶降解的作用。PEG 通常在LNPs 中占比最小，影響LNPs 的粒徑和電荷，在增強顆粒穩定性的同時阻止LNPs 聚集，在循環和生物分布過程中具有關鍵作用。此外，輔助性脂質（如磷脂和膽固醇）主要作用是支持顆粒結構，并在儲存和循環過程中增強穩定性[16-17]。

基于LNPs 的遞送載體在RNA 治療領域具有很好的應用前景，但其在體內的有效靶向輸送問題值得重視[18]。本研究基于“模仿自然”的觀念，利用天然細胞膜偽裝納米載體制備了HR-133a@F1-5LNPs 仿生納米運載系統，此系統具有類天然細胞的生物性能，因此兼具良好的生物相容性、同源靶向性、更低的毒副作用以及更長的體內循環時間[19]。Hu 等[20]將納米級的紅細胞膜包裹聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA），開發了一種新藥物遞送平臺。此平臺將紅細胞膜和聚合物載體的特點相融合，利用紅細胞膜表面的CD47 將藥物納米載體偽裝成“自我”而躲過了巨噬細胞的攝取和免疫系統的清除，有效延長了體內循環的循環時間，并靶向至病變部分。Wang 等[21]通過從血液中分離出血小板膜并將其修飾于聚合物表面，構建了一種全新的仿生載體。此載體表面修飾的血小板膜所保留的膜蛋白成分，可以有效地結合人類的膠原蛋白，并靶向孤立血管的損傷區域。Chen 等[22]報道了一種將癌細胞膜包覆于吲哚菁綠（ICG）聚合物核表面而組成的核-殼納米結構（ICNPs）。此ICNPs 具有源癌細胞相似的細胞粘附分子，有利于源癌細胞攝取膜結合的腫瘤抗原進行有效的呈遞和下游免疫的激活，而且可以通過同型結合機制，將ICNPs 精準地靶向至源癌細胞，進而實現更有效的治療效果。這種集天然細胞膜功能和納米載體功能于一體的納米載體在生物醫學領域中具有巨大的應用潛力和發展前景[23-24]。

在前期仿生研究的基礎上，本研究將心肌細胞膜（采用H 表示）修飾在搭載miR-133a 的脂質體（F1-5）納米顆粒R-133aF1-5LNPs（即F1陽離子載體在氮磷比（N/P）為5∶1 時吸附miR-133a 形成的納米顆粒）表面，構建了兼具高遞送效率和低細胞毒性的仿生基因載體HR-133a@F1-5LNPs。通過仿生基因載體HR-133a@F1-5LNPs 將miR-133a 遞送至肥厚性心肌細胞中，靶向結合RhoA 3′UTR 抑制RhoA/ROCK 信號通路，抑制了細胞周期重啟和細胞骨架的重新排列，調控了心肌肥厚的病理過程，達到抑制心肌肥厚和發揮基因治療的目的[9-10,14]，為心肌肥厚治療提供了一種新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ZS90 型納米粒度電位儀（英國Malvern 公司）；Tecnai G2 F20 S-TWIN 型透射電子顯微鏡（工作電壓200 kV，美國FEI 公司）；UH-100B 型超聲波細胞破碎儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Axio Observer 7全自動倒置熒光顯微鏡（德國ZEISS 公司）；Beckman Moflo-XDP 流式細胞儀（上海貝克曼庫爾特商貿有限公司）；TC-XP-D 博日基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀、NanoDroplite 分光光度計和EVOS M7000 型智能成像分析系統（美國Thermo Fisher 公司）；Multiskan FC型酶標儀、蛋白電泳轉膜系統和GeldocXR+凝膠成像系統（美國BioRad 公司）；Chemi Scope6200Touch化學發光成像分析系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。

MiR-133a（安徽通用生物系統有限公司）；GAPDH、BNP 和RhoA 引物（生工生物工程（上海）有限公司）；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（1,2-Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine，DSPC）和膽固醇（Cholesterol，CHO）（艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司）；1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（1,2-Dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000，DMG-PEG（2000））和鬼筆環肽（美國Avanit 公司）；血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ，美國MCE 公司）；聚乙酰亞胺（Polyethyleneimine，PEI，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國Corning 公司）；DAPI 溶液（即用型，北京索萊寶科技有限公司）。細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；M5 Hiper Universal RNA Mini Kit 組織/細胞RNA 快速提取試劑盒和M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover、2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix with High Rox、M5 Hiper Cell Counting Kit（CCK）CCK-8 細胞增殖與活性檢測試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）；One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit（12%）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂質納米粒(R-133a@FLNPs)的合成和篩選

分別稱取2 mg 陽離子脂質分子F1、F2和F3（結構見圖1）溶于1 mL 無水乙醇中（2 mg/mL），并按照推薦摩爾比[25]（陽離子脂質∶DSPC∶膽固醇∶DMG-PEG（2000）=50∶10∶38.5∶1.5）加入DSPC、膽固醇和DMG-PEG，分別制備F1-LNPs、F2-LNPs 和F3-LNPs；隨后，用200 μL PBS 溶液溶解1 OD（1 OD=40 μg）miR-133a（200 ng/μL）。F-LNPs 與miR-133a 的合成比例用氮磷比（N/P）表示，按照N/P 比為2.5∶1、5∶1 和10∶1，將乙醇相中F1-LNPs、F2-LNPs 和F3-LNPs 分別快速注入miR-133a PBS 相中，反復吹打混勻后，室溫孵育30 min，制備成3 種不同N/P 比的基因載體R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs，再采用PBS 溶液分別稀釋至終體積為1 mL，通過納米粒度電位儀檢測納米復合物的粒徑大小和表面電荷。

圖1 陽離子脂質F1、F2 和F3 的結構示意圖Fig.1 Structure diagram of cationic lipids F1,F2 and F3

為了評估R-133a@FLNPs 對核酸的濃縮能力，以陽離子載體的“金標準”PEI 作為對照。將按照不同N/P 比制備的一系列基因載體R-133a@FLNPs 稀釋至終體積為10 μL，室溫孵育30 min 后進行瓊脂糖凝膠阻滯實驗。在電壓為100 V 條件下電泳30 min 后，在凝膠成像儀下觀察，比較不同N/P 比載體與miR-133a 的結合能力，篩選出3 種納米顆粒結合miR-133a 的最佳比例。

將對數生長期的HL1 心肌細胞以8×103/孔的密度接種于8 孔共聚焦小室中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養過夜。待細胞生長至60%～80%時，分別加入R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs，繼續在培養箱中孵育12 h 后，棄去培養基，用預冷PBS 洗滌2 次，去除多余載體，再向其中加入DAPI 染液，避光處理10 min，預冷PBS 洗滌3 次（每次5 min）。通過激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細胞對不同組基因載體的攝取情況。Cy5 標記的miR-133a 的吸收波長為650 nm，發射波長為670 nm。DAPI 的吸收波長為358 nm，發射波長為461 nm。

王樹林出了電梯，手機已然開啟。并沒有再次出現短信。他快步地朝小區大門而去，雨未停，空氣清涼。一路上思磨著那兩個問號的意義，猶豫著是否要回撥一個電話。他和伍亦苒有過設定，他們的交往過程追尋的就是快樂?；罢蹠r直須折，莫待花落空折枝。任何一方沒有任何消息的時候一定有諸多不便，換句話說，另一方無須抱怨和勉強，他們都以不破壞現實狀態為最高出發點。

將HL1 心肌細胞接種于12 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養過夜。待細胞生長至60%～80%時，分別向其中加入R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs，培養箱中孵育12 h 后，棄去培養基，經胰酶消化處理并收集細胞懸液（2000 r/min，5 min）；用預冷PBS 洗滌2 次（1000 r/min，5 min）后，將其轉移至流式管中，進行流式細胞術分析；以未處理細胞為陰性對照，檢測Cy5 陽性細胞比例和熒光強度。

1.2.2 仿生基因載體(HR-133a@F1-5LNPs)的制備和表征

將處于對數生長期的HL1 心肌細胞接種于10 cm 細胞培養皿中，過夜培養后收集細胞，并按照細胞膜提取試劑盒（碧云天生物技術有限公司）說明書的要求提取HL1 心肌細胞膜。首先用預冷PBS 洗滌3 次，將細胞用細胞刮分離后收集于15 mL 離心管中，2000 r/min 離心5 min，留取細胞沉淀。向細胞沉淀中加入PMSF 終濃度為1 mmol/L 的膜蛋白抽提試劑A，并輕輕混勻，置于冰上裂解15 min。將細胞懸液轉移至預冷的玻璃研磨器，研磨30～50 次，收集裂解液；在4 ℃以2000 r/min 離心10 min，去除細胞核和未破碎的細胞。收集上清液，在4 ℃以14000 r/min 離心30 min，獲得的沉淀即為HL1 心肌細胞膜，于–80 ℃保存備用。

將HL1 心肌細胞膜重懸于去離子水中，超聲破碎混勻。將上述懸液在0.22 μm 過濾器上重復過濾10 次，使細胞膜均勻覆蓋于濾器的濾網上；將篩選出的最佳基因載體R-133a@F1-5LNPs 在同一濾器上過膜擠壓10 次，使細胞膜均勻覆蓋在基因載體表面，獲得仿生納米載體HR-133a@F1-5LNPs。采用透射電子顯微鏡（TEM）和粒徑分析儀對HR-133a@F1-5LNPs 的粒徑和基本形貌進行表征，并通過考馬斯亮藍染色評估HR-133a@F1-5LNPs 的膜包裹情況。

1.2.3 HR-133a@F1-5LNPs的生物安全性測定

將HL1 心肌細胞以5×103/孔的密度接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。更換培養基后，加入不同濃度（0～100 μg/mL）的R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI，繼續恒溫培養24 h。更換新鮮培養基后，加入CCK-8 試劑，于37 ℃避光孵育30 min，采用酶標儀讀取450 nm 處的吸光度，通過公式（1）計算細胞存活率（Cell viability，CV）。其中，As為加入陽離子基因載體的實驗組吸光度，Ac為未加入陽離子基因載體的對照組吸光度，Ab為不含細胞的培養基空白對照組的吸光度。

體外溶血實驗也是評估基因載體的生物相容性的重要指標之一。取2 mL C57BL/6J 小鼠外周血于EDTA 抗凝管中，分離血細胞重懸于PBS 中，加入濃度為25 μg/mL、N/P 比為5∶1 的R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI 重懸血紅細胞，在細胞培養箱中分別孵育12 和24 h。以PBS 處理為陰性對照，去離子水處理為陽性對照，采用分光光度計測定不同實驗組樣品在545 nm 處的吸光度，通過公式（2）計算紅細胞的溶血率（Hemolysis ratio,%）。將處理后的紅細胞分散在載玻片上，在顯微鏡下直接觀察紅細胞的形態，評估紅細胞的結構完整性。

1.2.4 體外心肌肥厚模型的建立及HR-133a@F1-5LNPs體外靶向性分析

通過AngⅡ刺激HL1 心肌細胞，模擬長期高血壓引起的心臟超負荷導致的心臟代償性肥厚，建立心肌肥厚的細胞模型[26]。采用體外評估心肌細胞相關肥厚基因（B-Type natriuretic peptide，BNP）和HL1心肌細胞體積變化情況驗證建模是否成功。將處于對數期的HL1 心肌細胞以2×105/孔的密度接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱過夜培養。更換無血清的MEM 培養基后，分別向其中加入不同濃度（1×10–5mol/L、1×10–6mol/L、1×10–7mol/L 和1×10–8mol/L）的AngⅡ培養液刺激處理48 h，測定誘導心肌細胞肥大的最佳藥物處理濃度。

采用M5 Universal RNA Mini Kit 試劑盒提取不同濃度組HL1 心肌細胞的總RNA，采用NanoDroplite紫外分光光度計測定RNA 的濃度。參照HiScriptIII RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆轉錄試劑盒說明書，配制逆轉錄反應體系，逆轉錄后將cDNA 置于–20 ℃保存備用。qPCR 反應擴增體系根據ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書在冰上進行配制。qPCR 數據分析時，選擇GAPDH 作為內參基因，采用2–ΔΔCt法計算不同濃度AngⅡ刺激的HL1 心肌細胞的BNP 相對表達量。引物序列：GAPDH Forward primer（5′-3′）∶GGTTGTCTCCTGCGACTTCA;GAPDH Reverse primer（3′-5′）∶TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC;BNP Forward primer（5′-3′）∶AAGAGAAAAGTCGGAGGAAATGG;BNP Reverse primer（3′-5′）∶TACAACAACTTCAGTGCGTTACAGC。

將處于對數生長期的HL1 心肌細胞接種于共聚焦小皿中，AngⅡ（1×10–7mol/L）刺激處理48 h，建立心肌肥厚的細胞模型。待心肌肥厚模型建立后，向每孔加入500 μL 4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，PBS 洗滌3 次，棄去溶液。向每孔加入200 μL 37 ℃預熱的鬼筆環肽染液，置于37 ℃恒溫培養箱中避光培養30 min。棄去染液后，以PBS 溶液洗滌3 次，加入DAPI 溶液（即用型）染色5 min，再經PBS溶液洗滌后，以激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細胞HL1 細胞形態，隨機選取5 個視野進行拍照，每個視野隨機選取10 個細胞，采用Image J 軟件計算心肌細胞表面積，取平均值，每組重復測量3 次。

將HL1 心肌細胞接種于共聚焦小皿中，AngⅡ（1×10–7mol/L）刺激處理48 h，建立心肌肥厚的細胞模型。分別加入R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 溶液處理12 h，棄去培養基，PBS 溶液清洗2 次，加入DAPI 染色5 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，在共聚焦顯微鏡下觀察肥厚性心肌細胞對HR-133a@F1-5LNPs 的攝取情況。

1.2.5 HR-133a@F1-5LNPs體外對心肌肥厚治療效果評價

為了驗證HR-133a@F1-5LNPs 是否將miR-133a 遞送至細胞中，將HL1 心肌細胞接種于6 孔板中，AngⅡ（1×10–7mol/L）刺激處理48 h，建立心肌肥厚的細胞模型。更換培養基，以PBS 處理組為對照，分別加入R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs，繼續培養12 和24 h。采用qPCR 測定HL1 心肌細胞中RhoA 基因的表達水平。引物序列：RhoA Forward primer（5′-3′）∶GTTGGTGATGGAGCTTGTGG;RhoA Reverse primer（3′-5′）∶CAGCTGTGTCCCATAAAGCC

將處于對數生長期的HL1 心肌細胞接種于6 孔板內，AngⅡ刺激HL1 心肌細胞，建立心肌的細胞肥厚模型。向其中分別加入PBS、R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI 繼續培養48 h。提取各處理組細胞中的蛋白質，并通過BCA 蛋白定量試劑盒測定各樣本的蛋白濃度。采用One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit（12%）試劑盒制備12%蛋白電泳膠，電泳槽中加入Running buffer 電泳緩沖液，每孔按相同蛋白量上樣，80 V 恒壓電泳25 min，隨后調整電壓為150 V 電泳1 h。隨后進行轉膜、封閉、孵育一抗、洗滌、孵育二抗和洗滌，加入發光液后，置于化學發光成像分析儀進行成像，檢測HL1 心肌細胞中的RhoA 的蛋白水平表達。

1.2.6 統計學分析

實驗數據以均數±標準差表示，采用Graphpad Prism 軟件對其分析，組間兩兩比較采用Student′s t檢驗，當p＜0.05 時，認為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 脂質納米粒(R-133a@FLNPs)的合成和篩選

如圖2A 所示，N/P 比分別為2.5∶1、5∶1 和10∶1 的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs 納米復合物的粒徑隨著N/P 比增大而逐漸減小，主要分布于70～300 nm 范圍內。相較于其它組別，N/P 比為10∶1 時各組的粒徑最小。表面Zeta 電位大約在25～40 mV 之間，隨著N/P 比值增加，電荷增大（圖2B）。這是由于陽離子表面帶正電荷，可以通過靜電作用將核酸縮合成尺寸更小的納米顆粒[27]。通過瓊脂糖凝膠阻滯實驗檢測陽離子載體F-LNPs 結合miR-133a 的能力（圖2C)，合成的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs 由于分子量變大而被阻滯在泳道口，而未被結合的miR-133a 會隨著電泳向正極移動，當miR-133a 完全結合時，相應的下端條帶消失。R-133a@F1LNPs 在N/P 比為5∶1 時可完全結合miR-133a，而PEI、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs 在N/P 比為10∶1 時才可完全結合miR-133a。

圖2 （A）不同氮磷（N/P）比的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a 的粒徑變化圖；（B）不同N/P 比的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a的電荷變化圖；（C）凝膠阻滯分析不同N/P 比的F1-LNPS、F2-LNPS、F3-LNPS 以及PEI 對miR-133a 的結合能力Fig.2 (A) Particle size variation of R-133a@F1LNPs,R-133a@F2LNPs,R-133a@F3LNPs,and PEI/miR-133a at different ratios of nitrogen to phosphorus (N/P);(B) Variations in charges of R-133a@F1LNPs,R-133a@F2 LNPs,R-133a@F3LNPs,and PEI/miR-133a at different N/P ratios;(C) Gel retardation analysis of the binding ability of F1-LNPS,F2-LNPS,F3-LNPS and PEI with miR-133a at different N/P ratios

為了篩選出遞送miR-133a 進入HL1 心肌細胞的最佳陽離子載體，以流式細胞術和共聚焦顯微鏡進行體外測定。流式細胞術結果（圖3A）顯示，采用R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a 分別處理HL1 心肌細胞后，隨著N/P 比增加，Cy5（Cy5 標記miR-133a）陽性細胞比例呈現先增高后降低的趨勢，這可能是因為在N/P 比為2.5∶1 條件下制備的3 種聚陽離子載體對核酸的結合能力較差，形成的納米顆粒尺寸較大，不利于細胞的內吞；當N/P 比為10∶1 時，雖然納米顆粒對核酸的濃縮能力變強，但在較高N/P 比下，基因載體的表面電荷增高，導致細胞毒性增加。如圖3B 和3C 所示，在N/P 比為5∶1 時，R-133a@F1-5LNPs 處理組的熒光強度和Cy5 陽性細胞比例（92.3%）遠高于其它處理組，而對照PEI 處理組的熒光強度和Cy5 陽性細胞比例最低，僅為20.9%。共聚焦熒光顯微鏡的檢測結果（圖3D）顯示，相較于其它處理組，R-133a@F1-5LNPS處理組的Cy5 紅色熒光信號最強，PEI 處理組的熒光信號最弱。

圖3 （A）不同N/P 比的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a 在HL1心肌細胞中的內化情況；（B）N/P 比為5∶1 時，HL1 心肌細胞對R-133a@F1-5LNPs、R-133a@F2-5LNPs、R-133a@F3-5LNPs 和PEI/miR-133a 攝取的平均熒光強度；（C）N/P 比為5∶1 時，R-133a@F1-5LNPs、R-133a@F2-5LNPs、R-133a@F3-5LNPs、PEI/miR-133a 在HL1 心肌細胞中的轉染效率；（D）在熒光顯微鏡下觀察HL1 細胞對R-133a@F1-5LNPs、R-133a@F2-5LNPs、R-133a@F3-5LNPs 和PEI/miR-133a 的攝入情況Fig.3 (A) Internalization of different N/P ratios of R-133a@F1LNPs,R-133a@F2LNPs,R-133a@F3LNPs and PEI/miR-133a in HL1 cardiomyocytes;(B) Average fluorescence intensity of R-133a@F1-5LNPs,R-133a@F2-5 LNPs,R-133a@F3-5LNPS and PEI/miR-133a uptake by HL1 cardiomyocytes at N/P ratio of 5∶1;(C)Transfection efficiency of R-133a@F1-5LNPs,R-133a@F2-5LNPs,R-133a@F3-5LNPs and PEI/miR-133a in HL1 cardiomyocytes at N/P ratio of 5∶1;(D)Observation of uptake of R-133a@F1-5LNPs,R-133a@F2-5LNPs,R-133a@F3-5LNPs and PEI/miR-133a by HL1 cells under fluorescent microscopy

綜上，在N/P 比為5∶1 時，R-133a@F1-5LNPs 納米復合物細胞遞送性能最佳，可作為心肌肥厚基因治療的最佳基因遞送載體。

2.2 仿生基因載體(HR-133a@F1-5LNPs)的制備和表征

采用心肌細胞膜包裹篩選出的最佳聚陽離子載體R-133a@F1-5LNPs 并制備成仿生納米載體HR-133a@F1-5LNPs。透射電子顯微鏡結果表明，R-133a@F1-5LNPs 呈球形，粒徑約為70 nm，水合粒徑結果顯示其分布較集中，平均粒徑為（71±1）nm；外層修飾HL1 心肌細胞膜的HR-133a@F1-5LNPs 納米顆粒也呈球形，并可觀測到一層膜結構包覆于表面，其粒徑約為90 nm；水合粒徑結果表明，HR-133a@F1-5LNPs 粒徑分布較集中，平均粒徑為（90±1）nm（圖4A）。為了進一步驗證HL1 心肌細胞膜已包覆于基因載體表面，通過考馬斯亮藍實驗測定HR-133a@F1-5LNPs 表面細胞膜蛋白水平。由圖4B 可見，HR-133a@F1-5LNPs 與HL1 心肌細胞膜的膜蛋白表達基本一致，而R-133a@F1-5LNPs 組未檢出蛋白。上述結果表明，HL1 心肌細胞膜已修飾在R-133a@F1-5LNPs 載體表面，即制備得到了仿生納米載體HR-133a@F1-5LNPs。

圖4 （A）R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 的粒徑分布和透射電鏡形貌圖；（B）R-133a@F1-5 LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和HL1 心肌細胞膜考馬斯亮藍染色結果Fig.4 (A) Particle size distribution and transmission electron microscopy (TEM) morphology images of R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs;(B) Results of Coomassie Brilliant Blue staining of R-133a@F1-5 LNPs,HR-133a@F1-5LNPs and HL1 cardiomyocytes membrane

2.3 HR-133a@F1-5LNPs的生物安全性測定

采用CCK-8 實驗評估不同濃度（0～100 μg/mL）HR-133a@F1-5LNPs 體外細胞水平的生物安全性。如圖5A 所示，隨著濃度增高，R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理組的HL1 心肌細胞的存活率略有下降，但仍大于90%。修飾HL1 心肌細胞膜的仿生載體HR-133a@F1-5LNPs 處理組細胞的存活率略高于R-133a@F1-5LNPs，并且兩組均顯著高于PEI/miR-133a 處理組的HL1 心肌細胞的存活率。采用25 μg/mL 的R-133a@F1-5LNPs、R-133a@HF1-5LNPs 和PEI/miR-133a 評估溶血率（圖5B），PEI/miR-133a處理紅細胞12 h 后，溶血率為25.4%；處理24 h 后，溶血現象更明顯，溶血率可達52.3%，遠高于生物材料允許的最大溶血率（5%）[28]。R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 對紅細胞產生的影響很小，處理24 h 后溶血率仍較低。同時，紅細胞的形態也可被用于評估納米顆粒溶血的發生情況。與PBS 處理組相比，PEI/miR-133a 處理組紅細胞的形態發生了明顯改變，而R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理組紅細胞的形態與PBS 處理組幾乎沒有差異（圖5C），因此，相比于PEI 組，R-133a@F1-5LNPs 組細胞毒性低，尤其是細胞膜修飾后，基因載體的生物安全性明顯提高。

圖5 （A）不同濃度的R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 對HL1 心肌細胞的毒性作用；（B）25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 分別處理紅細胞12 和24 h后，紅細胞的溶血率變化；（C）25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 處理紅細胞24 h 后紅細胞形態Fig.5 (A)Cytotoxic effects of different concentrations of R-133a@F1-5LNPs,HR-133a@F1-5LNPs and PEI/miR-133a on HL1 cardiomyocytes;(B) Changes in hemolysis rate of red blood cells after treatment with 25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs,HR-133a@F1-5LNPs and PEI/miR-133a for 12 h and 24 h,respectively;(C) Morphology of red blood cells after treatment with 25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs,HR-133a@F1-5LNPs,PEI/miR-133a for 24 h,respectively

2.4 HR-133a@F1-5LNPs體外靶向性分析

采用不同濃度（1×10–5mol/L、1×10–6mol/L、1×10–7mol/L、1×10–8mol/L）的AngⅡ刺激HL1 心肌細胞48 h，探索誘導心肌細胞肥大的最佳藥物濃度。qPCR 結果（圖6A）顯示，與對照組相比，不同濃度的AngⅡ刺激HL1 心肌細胞內的BNP 相對表達量均上調，其中，1×10–7mol/L AngⅡ組BNP 表達水平最高，差距具有統計學意義（p＜0.01），表明1×10–7mol/L 可能是誘導心肌細胞肥大模型的AngⅡ最佳濃度。通過鬼筆環肽染色HL1 心肌細胞骨架觀察其形態改變（圖6B），與對照組相比，AngⅡ誘導HL1 心肌細胞的細胞面積顯著增大，進一步通過軟件Image J 測量細胞面積（圖6C），也顯示兩者之間有顯著差異（p＜0.05）。

圖6 （A）使用不同濃度AngⅡ刺激HL1 48 h 肥厚基因B 型利鈉肽（BNP）的表達情況；（B）鬼筆環肽染色觀察細胞形態改變；（C）使用Image J 軟件對細胞面積進行統計分析結果，n=3，**p＜0.01 vs Control；（D）肥厚性HL1 心肌細胞對R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 的攝取情況Fig.6 (A)Expression of hypertrophy gene(B-Type natriuretic peptide,BNP)in HL1 cardiomyocytes after 48-h stimulation with different concentrations of AngⅡ;(B) Observation of cell morphology changes by Griffonia simplicifolia lectin staining;(C)Statistical analysis of cell area using Image J software,n=3,**p＜0.01 vs Control;(D) Uptake of R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs by hypertrophic HL1 cardiomyocytes

通過觀察肥厚性HL1 心肌細胞中的熒光信號，評估細胞對R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs的攝取。miR-133a 攜帶Cy5 熒光，在646 nm 左右的激發光下可以發出紅色熒光，包裹了心肌細胞膜的納米顆粒HR-133a@F1-5LNPs 處理組中的紅色熒光顯著高于未包膜材料組（圖6D），說明包裹HL1 心肌細胞膜后提高了HR-133a@F1-5LNPs 的靶向能力，體外實驗驗證了HR-133a@F1-5LNPs 具有更好的轉染能力，可以更好地協助納米顆粒進入細胞中。

2.5 HR-133a@F1-5LNPs的體外心肌肥厚治療效果評價

為了驗證HR-133a@F1-5LNPs 能否將miR-133a 遞送至心肌細胞中并發揮作用，采用qPCR 測定心肌肥厚相關基因的mRNA 的表達水平。結果如圖7A 所示，與PBS 對照組相比，HR-133a@F1-5LNPs 和R-133a@F1-5LNPs 處理組的RhoA mRNA 水平明顯降低，相較于R-133a@F1-5LNPs 處理組，HR-133a@F1-5LNPs處理組表達水平更低。這表明HR-1 33a@F1-5LNPs 可將miR-133a 遞送至心肌細胞中，并抑制了RhoA 的表達。

圖7 （A）qPCR 檢測HL1 心肌細胞經R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理12 h 和24 h 后RhoA mRNA 的表達水平；（B）Western blot 檢測HL1 心肌細胞經R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 處理24 h 后RhoA 和蛋白表達水平（1：PBS，2：AngⅡ，3:AngⅡ+R-133a@F1-5LNPs，4: AngⅡ+HR-133a@F1-5LNPs，5：AngⅡ+PEI/miR-133a）Fig.7 (A)Detection of RhoA mRNA expression in HL1 cardiomyocytes after treatment with R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs for 12 h and 24 h by qPCR;(B) Detection of RhoA protein expression levels in HL1 cardiomyocytes after treatment with R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs for 24 h by Western blot

采用Western blot 方法檢測了心肌肥厚細胞模型HL1 心肌細胞分別經R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR133a 處理后RhoA 的蛋白表達水平（圖7B）。與正常HL1 心肌細胞相比，在肥厚性的HL1 心肌細胞中RhoA 蛋白的表達明顯增高，而R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理組的心肌細胞中RhoA 蛋白的表達顯著下降，基本恢復至正常水平；PEI/miR133a 處理組的RhoA 蛋白表達水平相較肥厚組細胞有所降低，但仍顯著高于對照組。此結果表明，HR-133a@F1-5LNPs 可將miR-133a遞送至HL1 心肌細胞內，抑制RhoA 蛋白的表達，具有誘導細胞結構重排的潛力，從而實現治療心肌肥厚的目的。

3 結論

基于“模仿自然”和陽離子載體遞送的優勢，本研究采用心肌細胞膜修飾的方法制備了一種新型仿生陽離子基因遞送載體HR-133a@F1-5LNPs，既保留了心肌細胞膜的同源靶向特性，又具備陽離子載體充分包裹miR-133a 和促進細胞內化的雙重效應。在體外實驗中，此載體能夠特異性地將miR-133a 靶向遞送至心肌細胞，表現出優異的遞送效率，通過靶向結合RhoA 3′UTR 抑制RhoA/ROCK 信號通路，從而抑制了心肌細胞的重排和纖維化。此新型仿生遞送系統改善了由壓力超負荷而引起的心肌肥厚，為心肌肥厚的治療提供了一種新的思路。