丹皮酚腙類化合物的合成及其殺蟲活性研究

王瑞光，魏如雪，李 巖，田月娥，車志平

（河南科技大學園藝與植物保護學院，河南洛陽 471003）

在國家大力倡導發展綠色農業的今天，積極研發高效、低毒、作用方式獨特、具有自主知識產權的綠色農藥是我國農業有害生物有效防控以及抗藥性治理的迫切需求[1]。近年來我國在綠色農藥創制領域取得了長足的發展，但在原創性農藥活性化合物研發方面仍存在諸多短板[2]，發現結構和作用方式新穎、機理獨特、易于合成與修飾的農藥活性化合物是當前我國農藥科學基礎研究的核心內容之一。而以天然活性物質為先導進行結構優化是發現新型農藥分子的一條重要途徑，在綠色農藥研發方面發揮著重要的作用[3]。

丹皮酚（Paeonol）是從毛莨科植物牡丹（Paeonia suffruticosa）的根皮和蘿藦科植物徐長卿（Cynanchum paniculatum）的全株中提取、分離得到的一種酚酮類化合物，具有廣泛的藥理作用和農藥生物活性[4-5]。丹皮酚農藥生物活性廣譜，如對水果與蔬菜具有保鮮作用；對植物病原卵菌、真菌、細菌、病毒具有抑制作用；對害蟲具有胃毒、熏蒸及觸殺作用，對其產卵有忌避作用；對植物寄生線蟲具有較好的防效，且速效性好[4]。近年來，Che等[6-8]合成了系列丹皮酚類衍生物I～V，結構式見圖1，進一步測定了其殺粘蟲（Mythimna separata）活性，并發現了數個對鱗翅目（Lepidoptera）害蟲具有顯著毒殺活性的丹皮酚類化合物。

圖1 丹皮酚（Paeonol）及其衍生物（I～V）的化學結構

已有研究證明丹皮酚類化合物具有多種獨特的生物效應以及在科學研究、臨床醫學、農業上的應用價值[4-5]，為丹皮酚可能開發成新型農藥奠定了堅實的基礎。生物效應主要體現在：①丹皮酚可作用于乙酰膽堿酯酶（AChE），顯著影響突觸部位神經沖動的正常傳遞[9]。②丹皮酚穿過血腦屏障（BBB）運轉機制表明，其能主動通過H+/OC逆向轉運器穿過BBB進入大腦[10-11]。③丹皮酚能使小麥紋枯病菌（Rhizoctonia cerealis）菌體可溶性蛋白和還原糖含量顯著降低，幾丁糖含量顯著升高，嚴重影響菌體的正常生長[12]。④在不受酶的控制下，丹皮酚的活性羰基能與線蟲角質層中的蛋白質發生美拉德反應（Maillard reaction），生成糖基化末端產物（AGEs），促使角質層裂解，導致線蟲死亡[13-15]。⑤AGEs能夠刺激機體產生活性氧（ROS），從而抑制線蟲V-ATPase活性；細胞外基質（ECM）會因AGEs的增加而失去組織彈性，主要表現在膠原蛋白和彈性纖維的流失；糖化后的細胞內蛋白會失去原有的機能[13，16]。

以天然產物為先導創制具有自主知識產權的新農藥是農藥創新的有效途徑之一，丹皮酚以其特有的結構與生物活性而備受關注。丹皮酚具有廉價易得（既可以從植物中提取，也可以全合成[17]）、化學性質穩定、結構易于修飾等優點，具備作為新型農藥先導化合物的潛力。鑒于此，本文制備了21個3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物和18個3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物，在室內測定其對草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的毒殺活性，以期能發現具有潛在應用價值的化合物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

試驗主要儀器有Bruker-AV 400 MHz型核磁共振儀，瑞士Bruker公司；X-4數字顯示顯微熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司；質譜用LTQ Orbitrap Elite測定。

試驗所用試劑均為分析純，丹皮酚、酰肼、鹽酸肼、濃鹽酸、濃硝酸、濃硫酸和雙氧水均購自阿拉丁試劑網（https：//www.aladdin-e.com）；薄層層析和柱層層析硅膠購自青島海洋化工有限公司。

1.2 供試昆蟲

三齡前期草地貪夜蛾，由河南科技大學植物保護系害蟲防治實驗室提供。

1.3 化合物的合成

1.3.1 中間體5-硝基丹皮酚（A）和3-硝基丹皮酚（B）的制備

在100 mL燒瓶中加入丹皮酚（1，25 mmol）和H2SO4（20 mL），攪拌至完全溶解；將反應液置于低溫恒溫反應浴中冷卻至-30℃，后緩慢滴加HNO4（25 mmol），3～5 min滴畢；反應持續9 h，后將反應液在攪拌下倒入冰水（200 mL）中，析出大量顆粒狀固體，抽濾，水洗至中性，抽干，經硅膠柱層析分離，分別得到重要中間體5-硝基丹皮酚（A）和3-硝基丹皮酚（B），如圖2所示。

圖2 化合物A～C 的合成路線

A：產率29%，淺黃色固體，m.p. 125～126℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.03（s，1H）、8.50（s，1H）、6.55（s，1H）、4.01（s，3H）、2.64（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）210（[M-H]+，100）。

B：產率13%，淺黃色固體，m.p. 132～133℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.06（s，1H）、7.83（d，J=8.8 Hz 1H）、6.58（d，J=9.2 Hz，1H）、3.97（s，3H）、2.61（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）210（[M-H]＋，100)。

1.3.2 中間體3，5-二硝基丹皮酚（C）的制備

在100 mL燒瓶中加入丹皮酚（1，25 mmol）和H2SO4（20 mL），攪拌至完全溶解。將反應液置于低溫恒溫反應浴中冷卻至-30℃，后緩慢滴加HNO4（75 mmol），3～5 min滴畢；持續反應12 h，后將反應液在攪拌下倒入冰水（200 mL）中，析出大量顆粒狀固體，抽濾，水洗至中性，抽干，用乙酸乙酯重結晶得重要中間體3，5-二硝基丹皮酚（C）。

C：產率74%，淺黃色固體，m.p. 129～130℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：13.43（s，1H）、8.62（s，1H）、4.09（s，3H）、2.74（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）255（[M-H]+，100）。

1.3.3 中間體5-氯丹皮酚（D）的制備

室溫下，將丹皮酚（1，1 mmol）加入40 mL HCl（6.0 mol/L）溶液中；在15 min內，溶液從室溫緩慢升溫至45℃，然后加入30%H2O2（0.2 mL），將反應液在60℃下攪拌15 min。然后在冰浴中攪拌反應液直至充分產生沉淀，過濾沉淀，用石油醚洗滌并干燥，獲得關鍵中間體化合物D，如圖3所示。

圖3 化合物D 的合成路線

D：產率72%，淺黃色固體，m.p. 112～113℃。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：12.65（s，1H）、7.69（s，1H）、6.47（s，1H）、3.92（s，3H）、2.55（s，3H）。ESI-MS，m/z（%）201（[M＋H]＋，100）。

1.3.4 目標化合物1～21的制備

3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物（1～21）的合成及其結構表征見文獻[14]，結構式見圖4。

圖4 丹皮酚酰腙類化合物1～21 的化學結構

1.3.5 目標化合物22～39的制備

3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物（22～39）的合成及其結構表征見文獻[15]，結構式見圖5。

圖5 丹皮酚腙類化合物22～39 的化學結構

1.4 殺蟲活性測定

待測樣品：川楝素（Toosendanin），購自阿拉丁試劑網（https：//www.aladdin-e.com/zh_cn/），純度大于等于98%。

測定方法：①試蟲為三齡前期草地貪夜蛾，采用小葉碟添加法喂毒[18]，以川楝素為陽性對照，丙酮為空白對照，所測樣品質量濃度為1 mg/mL；②每一樣品設3個重復，每個重復挑選10頭健壯、大小均一的三齡前期草地貪夜蛾，飼養于直徑為9 cm的培養皿中，培養皿底部鋪一層濾紙以保濕；③將新鮮玉米葉片剪成1 cm×1 cm的小葉碟，在預先配好的樣品藥液和對照藥液中浸3 s，自然晾干后喂養試蟲，待試蟲吃完小葉碟后，及時添加小葉碟，飼養48 h后喂正常的葉片直至羽化；④飼養條件：溫度為（25±2）℃，相對濕度為65%～80%，光照時間12 h，黑暗時間12 h；⑤定期記錄試蟲的取食量、活口數和表現癥狀等。試蟲不同時期的校正死亡率計算公式為

2 結果與討論

2.1 合成部分

如圖2和3所示，①丹皮酚（1）與濃硝酸（HNO3）在濃硫酸（H2SO4）作用下反應合成重要的中間體A、B和C；②丹皮酚（1）與濃鹽酸（HCl）在30%雙氧水（H2O2）的作用下反應合成重要中間體D；③在醋酸（AcOH）催化下，中間體A～D分別與各種酰肼和鹽酸肼反應合成3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物（1～21）和3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物（22～39），所有化合物結構均通過1H NMR、MS和m.p.表征正確。

2.2 殺蟲活性

在1 mg/mL質量濃度下，采用小葉碟添加法測定化合物1～21和22～39殺草地貪夜蛾活性，商品化植物源殺蟲劑川楝素為陽性對照。

由表1和表2可見，在丹皮酚C-3、C-5位引入硝基或氯原子，并在其羰基位引入席夫堿（即酰腙和腙），其對應衍生物殺蟲活性顯著提高，大多數衍生物活性均高于母體丹皮酚，相當一部分衍生物活性甚至高于川楝素。從結果看，在1 mg/mL質量濃度下，所有供試化合物中5個化合物（12、13、30、32和34）表現出最好的殺蟲活性，最終校正死亡率分別為75.0%、71.4%、71.7%、71.4%和70.4%，其中致死率超過60%的有14個（包括上述5個化合物），相當或高于川楝素的達到26個（包括上述14個化合物）。整體而言，丹皮酚腙類化合物殺蟲活性優于丹皮酚酰腙類化合物。從時間角度觀察，與化學農藥如有機磷、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類顯著不同，該類化合物的殺蟲活性均隨著時間的推移呈逐漸上升趨勢，完全符合植物源農藥緩效的優點。

表1 丹皮酚酰腙類化合物1～21 殺草地貪夜蛾活性測定結果%

表2 丹皮酚腙類化合物22～39 殺草地貪夜蛾活性測定結果%

初步構效關系（structure-activity relationship，SAR）分析表明，就酰腙系列化合物1～21而言：①當X=NO2，Y=H時，其對應化合物殺蟲活性優于X=H，Y=NO2和X=NO2，Y=NO2，對應化合物最終校正死亡率1（42.9%）大于16（28.6%）大于18（39.3%），5（53.6%）大于17（35.7%）大于19（50.0%）；相比較而言，殺蟲活性均優于X=Cl，Y=H，即5（53.6%）大于19（50.0%）大于17（35.7%）大于20（25.0%）。②當R1為苯環時，其苯環上的取代基在對位時殺蟲活性優于鄰位，如8（64.3%）大于7（39.3%），12（75.0%）大于11（35.7%）。③當R1為雜環時，R1=2-thienyl的殺蟲活性優于R1=3-Pyridyl和R1=4-Pyridyl，其對應化合物和最終校正死亡率分別為13（71.4%）、14（50.0%）和15（39.3%）。④當R1為適宜長度碳鏈時，其對應的化合物有助于提高殺蟲活性，如2（53.6%）大于1（42.9%）大于3（39.3%），特別是R1為氰亞甲基時，其對應化合物4的最終校正死亡率為67.9%。

就腙系列化合物22～39而言：①當X=NO2，Y=NO2和X=NO2，Y=H時，其對應化合物殺蟲活性優于X=H，Y=NO2，對應化合物最終校正死亡率36（59.3%）大于22（50.0%）大于38（40.7%），34（70.4%）大于37（63.0%）大于39（48.1%）；②當R2=F或NO2時，其對應化合物殺蟲活性表現為間位優于鄰位和對位，即26（67.9%）大于25（64.3%）大于27（53.6%），34（70.4%）大于33（66.7%）大于35（59.3%）。③R2=Cl和R2=Br進一步證明了間位殺蟲活性優于鄰位，即30（71.7%）大于29（53.6%）和32（71.4%）大于31（63.0%）。④當R2=Me時，其對應化合物殺蟲活性表現為間位優于對位，即23（61.5%）大于24（50.0%）。

3 結論

為了發現具有潛在修飾價值的殺蟲先導化合物，進一步開發基于丹皮酚的綠色殺蟲劑，本文在1 mg/mL質量濃度下，采用小葉碟添加法測定了21個3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類化合物和18個3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類化合物對三齡前期草地貪夜蛾的毒殺活性。結果表明，所測共計39個目標化合物中5個化合物（12、13、30、32和34）表現出最好的殺蟲活性，其最終校正死亡率分別為75.0%、71.4%、71.7%、71.4%和70.4%，顯著高于陽性對照川楝素（50.0%）。特別是化合物12，其最終校正死亡率達到75.0%，表現出顯著的殺蟲活性；60%以上的目標化合物殺蟲活性相當或高于川楝素。該研究為今后選擇合成高殺蟲活性的3/5(3,5)-(二)硝基/氯丹皮酚酰腙類衍生物和3/5(3,5)-(二)硝基丹皮酚腙類衍生物及其在農藥創制方面的研究提供了一定的理論基礎。