高效液相色譜法測定山楂果中熊果酸和齊墩果酸

何鳳云,崔蓓蓓,邵大志,張長麗

(南京曉莊學院 環境科學學院,江蘇 南京 211171)

山楂為藥食兩用品種,在臨床應用廣泛,具有消食健胃,行氣散瘀,化濁降脂之功效,常用于肉食積滯,胃脘脹滿,瘀血經閉等癥。熊果酸(UA)和齊墩果酸(OA)是山楂中重要的活性成分。UA具有抗腫瘤、對肝損傷有保護、抗病毒抗菌作用[1]。OA具有廣譜抗菌藥物的特性,在臨床上常被用于護肝、降酶、治療急性肝炎等方面[2],因此測定山楂中UA和OA的含量,對于評價山楂質量具有重要意義。

圖1 熊果酸(UA)和齊墩果酸(OA)的結構式

UA和OA均為五環三萜酸類物質,如圖1所示,兩者為同分異構體,結構極為相似,不同之處僅僅是E環上的一個甲基的位置不同,因此同時測定UA和OA的難度大。目前同時測定UA和OA的方法有薄層色譜法[3]、氣相色譜法[4]、毛細管電泳法[5]、液相色譜法[6]。薄層色譜法操作較為繁瑣,氣相色譜法需要衍生化,毛細管電泳儀應用面較窄,液相色譜法應用最廣泛[7]。測定山楂及相關制劑中UA和OA多采用常規C18柱[8-17],分離時間在16～30 min之間;采用的流動相有甲醇-水[8-10]、甲醇-乙酸銨水溶液[11]或甲醇-磷酸水溶液[12,13]或甲醇-乙腈-乙酸銨水溶液[14,15]、甲醇-磷酸-三乙胺水溶液體系[16,17]。這些方法存在峰形和分離度不太理想或流動相組成復雜或出峰時間長等問題。緩沖鹽的加入會增加色譜柱平衡時間,三乙胺加入提高了分離效果但會嚴重影響色譜柱壽命。國內未見使用甲醇-甲酸水溶液分離UA和OA的報道。

本研究采用對C18柱友好的甲醇-甲酸水溶液體系,建立了同時測定山楂中熊果酸和齊墩果酸的液相色譜法,齊墩果酸和熊果酸在13 min內實現了基線分離,為山楂的質量控制提供依據。

1 實驗部分

1.1 試劑

甲醇(色譜純),娃哈哈純凈水,熊果酸(分析標準品,純度>98.5%,aladdin),齊墩果酸(分析標準品,純度>98%,aladdin),其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity II,配備DAD檢測器),紫外可見分光光度計(島津UV-2450),超聲波清洗儀(KQ3200DB, 昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱: Aupos Classical C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相:甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10);流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長210 nm;進樣量10 μL。

1.4 實驗方法

1.4.1 流動相的配制

甲醇超聲波處理20 min得到流動相A;移取甲酸220 μL,加入到1 L純凈水中,得到pH=3.0的甲酸水溶液,并超聲波處理20 min,得到流動相B。優化流動相組成,最終確定流動相組成為90% A-10% B(V/V)。

1.4.2 混合標準溶液的配制

精確稱取10 mg的熊果酸(UA)和5 mg的齊墩果酸(OA)于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容得到儲備標準溶液。用流動相稀釋得到分別含有UA 0.005、0.010、0.025、0.050、0.075、0.10 mg/mL,OA濃度為0.0025、0.005、0.0125、0.025、0.0375、0.050 mg/mL的混合標準溶液。

1.4.3 樣品溶液的配制

將山楂果清洗干凈,用小刀除去山楂果中硬核及其他雜質,在60 ℃恒溫干燥3.0 h,得山楂果干。精密稱取干燥后的山楂果干1 g左右,加30 mL乙醇溶液,在45 ℃、功率90 W下超聲波處理40 min,待冷卻、靜置,取上層清液經0.45 μm濾膜過濾后,進行熊果酸和齊墩果酸的含量測定。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

以甲醇溶液為參比,得到齊墩果酸和熊果酸的吸收光譜如圖2所示,從圖中可以看出兩者的最大吸收波長分別為205和208 nm,考慮到甲醇的截止波長為205 nm,選擇210 nm作為檢測波長。

2.2 分離條件的選擇

甲醇-水體系是反相色譜柱最為常用的體系,文獻中報道了甲醇比例為85∶15[8]、88∶12[9]、87∶13[10]可以實現UA和OA的分離。本文據此考察了不同比例的甲醇-水體系對分離的影響,如圖3所示。從圖3中可以看出,隨著流動相中甲醇的比例由85%到95%占比增加,兩組分保留時間逐漸縮短,分離度逐漸下降,甲醇含量到95%時,兩者已經不能實現基線分離。甲醇含量90%時分離情況較好,峰形尖銳,分離速度較快,綜合考慮分析分離情況、峰形和分析時間,選擇甲醇-水(90∶10, V/V)為流動相組成進行進一步條件優化。

圖2 UA和OA的紫外吸收波譜

圖3 UA和OA在不同流動相中的分離情況

熊果酸和齊墩果酸這類三萜酸類化合物由于帶有羧基,將流動相的pH值控制在2.0～3.0之間,可以抑制三萜酸類化合物的離解,改善峰形并提高分離度[17]。很多文獻中采用pH值為3.0的磷酸溶液控制流動相酸度。與磷酸相比,有機酸與流動相中的有機相互溶性更好,也更適合將方法推廣到質譜檢測器。與乙酸相比,甲酸酸性較強,較小濃度的酸,即可得到pH值為3.0的溶液。本文采用甲酸調節流動相pH值改善分離效果,如圖4所示,加入甲酸后,UA和OA保留時間略有增加,但峰形和分離度得到很大改善,分離度由2.16增加到2.96,提高了方法的耐用性。故后續實驗選用甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10, V/V)為流動相。

a. 流動相:甲醇-水(90∶10, V/V);b. 流動相:甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10, V/V)圖4 流動相酸度對分離的影響

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

將混合標準溶液依次進樣10 μL得到相應的色譜圖,記錄UA和OA的峰面積,分別以兩者的峰面積對其濃度作圖(圖5)。UA色譜峰面積與濃度在0.005～0.10 mg/mL范圍內呈良好線性,線性方程為:A=4017.6167c-0.60811(R2=0.99936);OA色譜峰面積與濃度在0.0025～0.05 mg/mL范圍內呈良好線性,線性方程為:A=3713.0899c-0.06517(R2=0.999)。

圖5 UA(a)OA(b)的標準曲線圖

2.3.2 精密度實驗

配制熊果酸濃度為0.10 mg/L,齊墩果酸濃度為0.05 mg/L的混合標準溶液,將其連續進樣6次,每次進樣10 μL,熊果酸峰面積的RSD為0.81%,齊墩果酸的峰面積的RSD為1.84%,表明該液相色譜條件系統適用性好(RSD≤2%)。

2.3.3 重復性實驗

精密稱取6份山楂果干,按照相同的條件和步驟制備樣品溶液,進樣10 μL,根據相應的色譜峰面積,計算得到UA峰面積的RSD為3.60%,OA的RSD為4.35%,重復性符合要求。

2.3.4 加標回收率實驗

精密稱取2份相同質量的山楂果干,其中1份加入已精密稱定的熊果酸標準品0.4 mg和齊墩果酸標準品0.5 mg。按照相同的條件和步驟制備樣品溶液,樣品(圖6a)和加標樣品(圖6b)的色譜圖如6所示,經計算UA的加標回收率為97.5%,OA的回收率為98.0%。

a. 樣品;b. 加標樣圖6 加標回收率試驗色譜圖

2.4 樣品測定

精密稱取6份山楂果干,按照相同的條件和步驟制備樣品溶液,進樣10 μL,根據相應的色譜峰面積代入線性回歸方程,求得山楂中UA和OA的量分別為1.20 mg/g和0.57 mg/g。

3 結 論

本研究以Aupos Classical C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)為色譜柱,甲醇-甲酸水溶液(pH=3.0)(90∶10, V/V)為流動相,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長210 nm對齊墩果酸和熊果酸進行分離檢測,并將該方法用于山楂中齊墩果酸和熊果酸的含量進行檢測。該方法與現有測定山楂中兩者成分的文獻相比,具有流動相構成簡單、出峰時間快、分離效果好、色譜分離前處理和后運行時間少等優點,可用于山楂果的質量控制研究。