具核梭桿菌促進結直腸癌發生發展機制的研究進展

羅婉逸 韓居熺 周學東,2 彭顯,2 鄭欣,2

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫學院 成都 610041；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院牙體牙髓病科 成都 610041

具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F.nucleatum）是革蘭陰性厭氧菌，廣泛定植于人體口腔和腸道等器官，與牙周病的發生發展有著密切的關系[1-2]。作為一種機會致病菌，F.nucleatum還被發現與全身系統性疾病相關，如心血管疾病[3]、骨關節炎[4]、妊娠不良事件[5]及各系統腫瘤[6-9]等。近年來，F.nucleatum被發現與結直腸癌（colorectal cancer）的生物學行為改變有直接的密切關系，二者的關系得到了廣泛的研究。本文就F.nucleatum黏附、定植、遷移以及對結直腸癌的影響與作用機制進行綜述，為進一步研究F. nucleatum與結直腸癌之間的相互作用提供依據。

1 牙周炎與結直腸癌相關性的研究

目前流行病學的研究結果并不支持牙周炎與結直腸癌之間有明確的關聯性[10]。Michaud等[11]通過隨訪調查發現：在排除已知風險因素（包括吸煙史和飲食因素）的影響后，患結直腸癌風險與自我報告的牙周炎（風險比為1.05，95%置信區間為0.90~1.23）或牙齒缺失（風險比為1.10，95%置信區間為0.87~1.37）并沒有顯著聯系。在一項針對日本成年人的病例對照研究[12]中，研究者采用牙齒脫落數量作為牙周炎的代替指標，結果發現：與余留牙齒在21顆以上的群體相比，不同程度的牙齒缺失（剩余0、1~8和9~20 顆牙齒）和患結直腸癌風險之間沒有顯著關聯。Ren等[13]進行了一項嵌套病例對照研究，該研究基于3個隊列，在分析結果時將其中2個中國隊列合并，為上海男性和上海女性（病例組n=825，對照組n=3 298），第3個是美國南方社區隊列（病例組n=238，對照組n=2 258）。在上海男性/上海女性或美國南方社區隊列研究中，結果均發現不同的牙齒脫落數量與結直腸癌風險之間沒有關聯。還有研究[14-15]將患者自我報告作為牙周炎的代替指標，結果發現在絕經期婦女[14]和從不吸煙[15]的婦女中，牙周炎和患結直腸癌的風險沒有相關性。

結直腸癌患者病灶處的F.nucleatum與口腔中的具有同源性。Komiya等[16]通過隨機引物聚合酶鏈式反應（arbitrarily primed-polymerase chain reaction，AP-PCR）技術比對了結直腸癌患者腫瘤病灶處與唾液中的F. nucleatum，結果發現：超過40%的患者結直腸癌腫瘤處與口腔中具有相同的F.nucleatum菌株，提示腸道F.nucleatum主要起源于口腔。F.nucleatum在何種情況下可以從口腔位移到結直腸并對結直腸癌的進展產生影響？Kitamoto等[17]的研究發現：口腔病原菌只有在同時滿足腸道炎癥及牙周炎癥兩個狀態時，才能在腸道異位定植，并進一步通過炎癥因子白細胞介素（interleukin，IL）-1β及致病性T細胞加劇腸道炎癥，腸道炎癥的加劇會導致結直腸癌發生風險的增加，促進炎癥向結直腸癌的轉變[18-20]。腸道炎癥狀態下的腸道菌群缺乏定植抗性，同時牙周炎增加了口腔病原體的豐度并增加了口腔病原體成功通過胃中酸性環境的可能性，使得攝入的病原體達到一定的閾值，得以在腸道成功定植。由此可見，單純患有牙周炎的患者，腸道菌群存在定植抗性，口腔來源的病原菌難以異位定植；而對于本身存在腸道炎癥這一狀態的患者而言，牙周炎或許會成為一個促進炎癥向癌癥轉變的風險因素。

2 具核梭桿菌的遷移機制

基于以上研究結果，F.nucleatum需要從口腔遷移到腸道才能進一步發揮作用，而F.nucleatum的遷移機制尚未完全明晰。目前學者們[21-23]提出了具有較高可能性的兩條途徑：一是自口腔通過消化道到達腸道[22]；二是從口腔進入血液，通過循環系統到達腸道[23]。目前已有大量相關的動物實驗及臨床研究用于佐證以上兩個觀點。

2.1 通過消化道遷移

臨床研究[24-26]發現：在結直腸癌患者中，F.nucleatum在腫瘤病灶中的檢出率從直腸（2%）向盲腸（11%）逐漸富集，所有子位點之間呈線性上升（P<0.000 1），腫瘤位置靠近上端的結直腸癌患者中F. nucleatum豐度較高，盲腸癌的F. nucleatum檢出率最高?；谶@些研究結果，Nakajima等[22]提出了F.nucleatum可自口腔吞入，經過消化道（食管、胃、小腸）到達結直腸，并通過特定的黏附機制定植于腫瘤病灶處的觀點。在Apc-Min/+小鼠模型中，經口飼喂F.nucleatum可以促進小鼠結直腸腫瘤的發展，提示F.nucleatum是從口腔進入胃腸道[27]。

F.nucleatum作為口腔常見的條件致病菌，是長期存在于正常人體的革蘭陰性桿菌，可伴隨攝食飲水等日?；顒舆M入胃腸道。除此以外，F.nucleatum還可隨分泌的唾液進入消化道下段。健康成人1 d分泌的唾液量為0.5~1.5 L[28]，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）對健康成人唾液中的F.nucleatum進行定量，數量可達（6.35±0.78） log10copies·mL-1，在結直腸癌患者體內更是高達 （6.89±1.07） log10copies·mL-1[29]，每天均有大量的F. nucleatum持續地被吞入胃中。F.nucleatum進入胃內后，胃酸會對不能抵抗酸性環境的細菌起到殺滅作用[30]。雖然F. nucleatum的抗酸機制還未得到具體闡明，但在動物實驗[31-32]中，無菌小鼠體內F.nucleatum具有克服小鼠胃內物理屏障，定植到腸道內的能力。研究[32]表明：F.nucleatum可在無菌小鼠的腸道內定植并占據優勢，但在接種腸道菌群后，F.nucleatum豐度顯著下降；健康個體的腸道菌群對F.nucleatum有顯著的抵抗作用，F.nucleatum難以突破微生物屏障。但在結直腸癌患者體內，腸道菌群發生改變[33]，有助于維持腸道生態穩定的有益菌數量減少[34]，可引起炎癥或代謝性疾病的條件致病菌增多，微生物屏障的抵抗作用減弱，F.nucleatum得以成功定植。

2.2 通過血液循環系統遷移

除了消化道遷移外，血液循環是另一種口腔細菌定植腸道的途徑[35]。研究[35]發現，采取尾靜脈注射的方式向小鼠給予F. nucleatum，發現F. nucleatum大量定植于小鼠結直腸腫瘤組織處，且腫瘤組織中F. nucleatum的豐度明顯高于鄰近正常組織。

所有的日?；顒?，包括刷牙、咀嚼、吞咽等都有可能導致F.nucleatum從齦溝或口腔內的細小傷口進入血液[36-37]。牙周炎發生時，F.nucleatum數量顯著增加，牙周炎患者刷牙后15 min，血液中的細菌密度可達每毫升104個，同時牙齦內血管因炎癥擴張，大量F.nucleatum得以進入人體血液循環[35,38]。除此之外，F. nucleatum可通過黏附素FadA與血管內皮細胞鈣黏連蛋白（VE-cadherin）結合，破壞血管內皮細胞之間的細胞結合，使得血管通透性增加，F.nucleatum得以通過疏松的細胞間連接進入血管內，進而通過血液循環到達全身各處組織中[39]。

進入血液循環后，F.nucleatum面臨著宿主免疫系統的威脅，為逃避宿主體內免疫系統的吞噬作用，細菌會入侵并寄生于宿主細胞內[40]。F.nucleatum是一種兼性胞內寄生菌，可入侵宿主的巨噬細胞，并通過表達吲哚胺2,3-二氧化酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）抑制外周淋巴細胞活性，使得被感染的巨噬細胞免于被清除[41]。

3 F. nucleatum 在結直腸癌組織中黏附定植的機制

F.nucleatum到達腸道后，在腫瘤病灶處富集，正常腸黏膜處F. nucleatum的豐度明顯低于病灶處[42]。F. nucleatum在腫瘤病灶處高度聚集的可能原因有兩個：一是F.nucleatum與結直腸癌細胞之間存在特異性結合，二是F.nucleatum對腫瘤內部的微環境有較強的適應能力。

3.1 F.nucleatum與結直腸癌細胞的特異性結合

Rubinstein等[43]通過共免疫沉淀檢測方法檢測到，結直腸癌病灶處，F.nucleatum表面的黏附素FadA可以與結直腸癌表面的上皮細胞鈣黏蛋白E-cadherin特異性結合，介導F. nucleatum黏附侵襲。黏附素FadA是F.nucleatum的一種毒力因子，起到黏附侵襲上皮細胞的作用。E-cadherin是一類鈣依賴的細胞黏附糖蛋白，每個蛋白由5個胞外重復結構域（EC1—EC5）、一個跨膜結構域及一個結合p120連環素和β-連環素的胞內結構域組成。FadA與E-cadherin的結構域EC3結合，進一步通過激活E-cadherin介導的信號通路促進腫瘤的發生發展。糖類腫瘤標記物gal-GalNac作為結直腸癌的生物標記物，在結直腸癌細胞表面大量表達，可被F.nucleatum表面的黏附素Fap2識別，并在特異性結合后完成定植。在小鼠結直腸癌模型中，相比于野生型的F.nucleatum，天然缺乏Fap2的菌株或滅活Fap2的突變株與表達gal-GalNAc的結直腸癌細胞結合率明顯下降，再次證明Fap2可介導F. nucleatum與 gal-GalNAc結合[23]。

3.2 F.nucleatum對腫瘤內部微環境的適應能力

為了滿足腫瘤快速發展的需求，腫瘤采用了與人體普通細胞不同的代謝機制。這種特殊的代謝方式導致腫瘤內部微環境呈酸性，乏氧，和/或缺乏免疫細胞所需關鍵營養物質的狀態[32]。無氧環境中，F.nucleatum具有相對較高的活性與繁殖力，同時缺乏免疫細胞的環境使得F.nucleatum的數量得以迅速增加，使F.nucleatum定植并快速繁殖[44-45]。結直腸癌細胞攝入葡萄糖能力較強，腫瘤微環境中乏糖，F.nucleatum可利用葡萄糖以外的碳源作為營養來源，F.nucleatum可以通過氨基酸的發酵獲得能量，對腫瘤微環境有較強的適應能力[46-47]。F.nucleatum通過作用于調控糖酵解的關鍵酶alpha-Enolase的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA enolase1-intronic transcript 1， lncRNA ENO1-IT1）促進結直腸癌進行糖酵解，進一步促進腫瘤的生長[48]。F.nucleatum通過上調轉錄因子SP1（specific protein 1）與lncRNA ENO1-IT1啟動子區域的結合率來激活lncRNA ENO1-IT1的轉錄。升高的ENO1-IT1作為組蛋白乙酰轉移酶的編碼基因 （lysine acetyltransferase 7，KAT7） 的導向模塊，指定其靶基因（包括ENO1）上的組蛋白修飾模式，改變結直腸癌的生物學功能。本課題組[49]研究發現：F.nucleatum通過促進組蛋白乙?；揎梺砩险{人血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）表達，進而促進結直腸癌細胞攝入葡萄糖及增強糖酵解水平。F.nucleatum在腫瘤組織內的定植與生存依賴于腫瘤細胞高水平的糖酵解活性，提示兩者可在腫瘤微環境中形成互利共生關系。

4 F.nucleatum影響結直腸癌發生發展的機制

4.1 促進腫瘤細胞生長

研究[40,43,50]表明：F. nucleatum表達的黏附素FadA與結直腸癌細胞的E-cadherin特異性結合后可通過多種機制激活并上調Wnt/β-catenin信號調節通路，促進腫瘤細胞的生長。Rubinstein等[50]發現：通過FadA與結直腸癌細胞的E-cadherin特異性結合，F.nucleatum能促進表達E-cadherin的結直腸癌細胞的增殖，但對不表達E-cadherin的結直腸癌細胞無明顯促進作用。E-cadherin是一種通過β-鏈蛋白（β-catenin）發揮作用的腫瘤抑制因子[51-52]，正常情況下可抑制F.nucleatum導致的腫瘤生長與炎癥反應，但FadA與E-cadherin結合后，激活了Wnt/β-catenin信號通路，導致原癌基因過表達，上調相應蛋白G1/S-特異性周期蛋白-D1的編碼Cyclin D1的過表達，促進結直腸癌細胞的生長。除此之外，FadA與E-cadherin結合后，還可以上調信號蛋白ANXA1（Annexin A1） 的表達。在Rubinstein等[50]的研究中發現：Annexin A1 是一種Wnt/βcatenin信號調節器，在腫瘤細胞中特異性表達，是Wnt/β-catenin信號通路激活所必需的。同時，FadA與Annexin A1陽性的癌細胞之間存在正反饋循環，可以促進癌細胞迅速增殖。

F.nucleatum可通過RAS蛋白/絲裂原活化蛋白激酶通路（Ras-Raf-MEK-ERK mitogen activated protein kinase，RAS/MAPK）促進腫瘤細胞生長。F.nucleatum表 面 的 脂 多 糖 （lipopolysaccharide，LPS）與結直腸癌細胞表面的Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）受體結合，激活TLR4與髓樣分化因子 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）結合，使信號向下游轉導，進而激活核因子-κB （nuclear factor kappa B，NF-κB），上調非編碼單鏈RNA的表達。非編碼單鏈RNA可以通過影響腫瘤組織中T細胞與髓樣細胞的浸潤，上調腫 瘤 壞 死 因 子 -α （tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、IL-6、IL-17A、IL-21等因子在組織中的表達，影響上皮細胞增殖[53]。同時在過度表達miR21的細胞中，RASA1持續下調。RASA1作為RAS功能的抑制因子，增強RAS蛋白內在微弱的G蛋白活性，使得RAS 進入失活的二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）結合態，從而抑制細胞增殖和分化。隨著RASA1表達的下調，結直腸癌細胞的增殖逐漸失去控制[54]。

4.2 抗化學治療作用

臨床研究[55]發現：病灶處F.nucleatum豐度高的結直腸癌患者往往預后不佳，且化學治療（簡稱化療）后腫瘤復發的結直腸癌患者腫瘤樣本中豐度明顯高于未復發者，由此可見F.nucleatum可增強結直腸癌的化療耐藥性。Yu等[56]發現：F.nucleatum通過表面LPS與TLR4結合，激活TLR4，使之與髓樣分化因子MyD88結合并激活信號通路NF-κB，下調細胞內miRNA-18a*（*示表達水平較低）和miRNA-4802的表達，使得自噬相關元件ULK1 蛋白 （unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1） 和ATG7蛋白 （autophagy related 7，ATG7）的表達上調，進而啟動自噬，而自噬作為一種保護機制可以起到對化療藥物（5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑）的抵抗作用。此外，通過信號通路NF-κB，還可以通過上調自噬相關基因BIRC3（baculoviral IAP repeat containing 3）的表達來降低結直腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[57-59]。

4.3 促進腫瘤轉移

據統計，伴有遠端轉移的結直腸癌患者5年生存率不足10%[60]，但結直腸癌發生轉移的機制尚未完全明晰。Li等[61]通過對101個結直腸癌患者的腫瘤組織與癌旁正常組織進行檢測，發現淋巴結轉移組的患者F.nucleatum豐度明顯高于未轉移組，提示F.nucleatum的感染與腫瘤的發展和轉移有關。

F.nucleatum感染結直腸癌細胞通過激活NF-κB通路上調蛋白KRT7-as （keratin7-antisense）/角蛋白KRT7（keratin7）的表達，促進結直腸癌細胞體外轉移和體內肺轉移。在清除KRT7-as后，F.nucleatum導致的結直腸癌體內肺轉移受到抑制[62]。KRT7-as上調KRT7的表達，KRT7屬于Ⅱ型細胞角蛋白，是細胞骨架和上皮中間絲的組成部分，還可以促進細胞運動[63-65]。臨床研究發現：KRT7在有淋巴結轉移的患者體內表達更活躍，且高豐度的F.nucleatum與更高的腫瘤出芽分級程度明顯相關[66-67]。通過NF-κB通路，F.nucleatum還可以上調CARD3（caspase activation and recruitment domain 3）蛋白的表達，促進自噬，增加體內外的上皮間充質轉換，促進結直腸癌的轉移[68]。

F.nucleatum通過影響結直腸癌細胞的外泌體來促進轉移的發生。腫瘤細胞釋放的外泌體由特定的RNA和蛋白質載體組成，在促進腫瘤進展的過程中起到重要的調節作用[69]。被F.nucleatum感染后的結直腸癌細胞會釋放富含miR-1246/92b-3p/27a-3p和CXCL16/RhoA/IL-8的外泌體，外泌體miR-1246/92b-3p/27a-3p通過與糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）β靶向結合和激活Wnt/β-catenin通路促進結直腸癌細胞遷移[70]。

F.nucleatum在腫瘤細胞中的定植，在遠端轉移處依舊維持，即在遠端轉移的腫瘤細胞中也發現了F.nucleatum的感染，證明了原發性腫瘤和與之配對的轉移灶的微生物組具有穩定性。隨結直腸癌到達轉移灶的F.nucleatum還可以進一步促進轉移灶的增殖與分化[62,68,71]。

4.4 調控腫瘤免疫微環境

Kostic等[27]發現：F.nucleatum感染在ApcMin/+小鼠模型（一種小鼠自發性結直腸癌癌前病變模型）中，通過選擇性地招募浸潤腫瘤的髓系細胞，產生了有利于結直腸癌進展的促炎微環境。骨髓來源抑制性細胞是一類免疫抑制細胞，已被證實能抑制T細胞的功能，促進腫瘤的生長[72-73]。Gur等[74]發現：在F.nucleatum存在的條件下，自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）對各種腫瘤的殺傷作用可以被抑制。免疫抑制性受體TIGIT（T cell immunoglobulin and ITIM domain） 是一種存在于所有人類NK細胞和各種T細胞上的抑制受體，F.nucleatum表面的Fap2蛋白可直接與TIGIT相互作用，從而抑制NK細胞的細胞殺傷能力。腫瘤浸潤淋巴細胞同樣表達TIGIT，同樣F.nucleatum可通過Fap2抑制T細胞活性。F.nucleatum通過TLR4依賴性機制促進腫瘤微環境中巨噬細胞的M2極化[75]。癌癥微環境中的巨噬細胞可分化為M1 表型（阻礙腫瘤進展）或M2 表型，M2極化的巨噬細胞可增強腫瘤細胞增殖、遷移、血管生成和轉移的能力[76-77]。F.nucleatum感染可能以TLR4依賴性方式激活巨噬細胞中的IL-6/p-STAT3/c-MYC 信號通路，從而控制巨噬細胞向M2型分化[78]。

5 展望

結直腸癌作為全球發病率第二的消化道腫瘤，F.nucleatum在其中起到的作用一直受到廣泛的關注。隨著人們對F.nucleatum在結直腸癌中可能機制的研究，F.nucleatum逐漸成為診治結直腸癌及預后評估的研究重點。F.nucleatum可激活多個信號通路來調節機體腫瘤基因表達、蛋白分泌水平、免疫功能，在結直腸癌發生發展的各個階段起到促進作用。高豐度的F.nucleatum不僅可以促進腫瘤細胞的生長分裂，還可以降低腫瘤細胞的敏感性，促進遠端轉移以及調控免疫環境，因此F.nucleatum不僅可以作為靶點治療結直腸癌，還可以用于腫瘤的預后評估。F.nucleatum與結直腸癌之間的相互作用有深入研究的價值，值得更進一步的探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。