高通量測序技術在病原體檢測中的臨床應用進展

盧美伊， 朱志軍， 胡開明， 朱 梅

病原體檢測對臨床診斷與治療有著重要指導意義。當前臨床病原學診斷方法主要有培養法、鏡檢法、PCR法、免疫學方法（包括熒光法、ELISA法、層析法）和測序技術等，其中以培養法結果陽性為“金標準”。但依賴傳統方法仍有許多感染性疾病被漏診。幾乎所有的感染性疾病病原體都含有 DNA 或 RNA 基因組，因此基因組測序成為了病原體檢測的一種極佳方法。這種新興的方法正在改變臨床醫師診斷感染性疾病的方式，其應用范圍涉及廣泛的領域，包括微生物組學、抗生素耐藥性[1]。測序技術的不斷發展大大提高了病原體的檢出率，本文主要討論第二代測序技術在病原體檢測方面的應用。

1 測序技術概述

1976年，Sanger等[2-3]報道了一種測定DNA中核苷酸序列的方法，并于1977年測定了噬菌體?X174的基因組序列，自此病原體檢測進入了基因組學時代，這種方法被稱為第一代測序技術。但其測序成本高且通量較低，嚴重影響了這一技術的大規模推廣使用。

2005年，新一代測序技術的出現開啟了宏基因組學領域。二代測序技術（next-generation sequencing，NGS），也稱下一代測序技術，可以同時讀取百萬到數十億條核酸序列，理論上能夠分析一個臨床或環境樣本的所有基因序列。在隨后的十年中，在可用測序儀器激增和測序成本下降的形勢下，NGS已儼然成為檢測患者臨床樣本中的微生物并進行分類的一個有效技術平臺[4]。毫無疑問，測序技術已經改變了生物醫學研究，越來越多可用的生物體全基因組序列測序是分子生物學實驗的一個有價值的工具[5]。到目前為止，許多研究都表明了NGS在臨床和公共衛生等領域發揮了巨大作用，比如2019年底暴發的不明原因肺炎疫情便是借助NGS從患者肺泡灌洗液樣本中獲得了病原體基因組序列，進而通過分離、培養、擴增、對比等方法確定了病原體是結構與SARS冠狀病毒極為相似的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）[6]。NGS已成為感染性疾病精準診斷與治療的關鍵驅動因素，有助于實現患者的精準與個體化診療。

第三代測序技術（third generation sequencing technology）也稱單分子實時測序技術，其特點是讀長較長，且在進行DNA測序時不需要經過PCR擴增，而是對每一條DNA分子進行單獨測序。但就目前實際應用來說，第二代測序技術仍處于主流地位。

2 高通量測序技術在不同感染中病原體檢測上的應用

2.1 中樞神經系統感染

中樞神經系統感染的潛在病原體很多，腦脊液（CSF）是臨床上診斷中樞神經系統感染的主要樣本。CSF在側腦室脈絡叢生成，存在于腦室及蛛網膜下腔中，盡管臨床上已有不少診斷性檢測技術，但在某些情況下仍然會遺漏一些病原體。早在2008年就有學者報道使用GSL FLX平臺，在移植術后患者的CSF中檢測出沙粒病毒的病例[7]；2013年，兩個獨立實驗室通過PCR和Sanger測序證實了1例反復發熱、頭痛、畏光等癥狀入院的患兒CSF中鉤端螺旋體的存在，這是1例罕見的、由神經鉤端螺旋體引起的急性發作后持續感染數月的慢性病例[8]；2016年，越南胡志明市牛津大學臨床研究中心第一次在尿液中通過深度測序檢測到乙腦病毒，隨后通過RT-PCR和血清學證實[9]。這些報道證明了宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）能夠為臨床中樞神經系統感染提供有價值的診斷信息，準確的診斷可以指導合適的靶向抗生素治療，促進患者的最終康復。許多學者進行了一系列小樣本量研究[10-12]，探討NGS用于中樞神經系統感染的臨床價值，結果顯示mNGS的診斷靈敏度、特異度、Youden指數都較傳統病原學檢測高，且根據送檢CSF病原體mNGS的客觀標準評分，mNGS的陽性準確率隨著評分的增加呈升高趨勢。雖然mNGS已經顯示出診斷臨床中樞神經系統感染的能力，但是作為新一代檢測手段，它仍然不能取代培養法的必要性，二者的相互補充可進一步提高確診率。

2.2 呼吸道感染

肺臟是人類呼吸的主要器官，肺炎是一種常見的感染。肺部感染一經診斷通常會使用抗生素進行治療，這便限制了傳統培養法的使用。痰液和支氣管肺泡灌洗液（BALF）是肺部感染病原體檢測的主要樣本，BALF是通過纖維支氣管鏡對深部肺段（支氣管以下的肺段、亞肺段水平）用無菌生理鹽水進行反復灌洗、回收獲取的肺泡表面襯液樣本。因此BALF的病原學檢查在呼吸系統疾?。ㄓ绕涫窍潞粑兰膊。┑脑\斷、指導用藥、療效觀察及預后判斷等方面有著重要的意義。mNGS采用定量檢測的方法鑒定病原體[13]，臨床研究也證實了其相對于傳統方法的臨床效用[14-19]。此外，NGS的高通量和大規模測序可同時檢測出細菌、真菌、病毒，特別是對于病毒和真菌感染[20]，因此該技術在肺部混合感染上顯示出了獨特的優勢[17]。更廣的病原體檢測譜還有利于細菌多樣性分析，臨床上下呼吸道感染通常是微生物群和宿主之間相互作用導致，病原體并不只是一種單一的微生物[21]，一項用mNGS鑒定肺炎患者呼吸道病原體的研究發現，經培養證實感染的個體其呼吸道微生物組的多樣性明顯較低[22]，這一研究結果提示以微生物群為切入點或許可以為呼吸道感染的診斷和治療指引方向。

2.3 膿腫

膿腫多由微生物感染引起，表現為人體各器官或系統的局部組織壞死，盡管醫學診療在不斷發展，但仍有很大比例的患者預后不佳，導致功能受限甚至殘疾（如骨關節膿腫），生活質量低下?？焖?、準確地鑒定臨床膿腫樣本中的病原菌，對臨床醫師準確選擇抗菌藥物進行治療具有重要指導意義。全宏基因組鳥槍法測序（wholemetagenomeshotgun sequencing，WMGS） 在 2018年被用于檢測1例布魯氏菌肝膿腫6年后臨床復發的病例，該病例血液和膿腫液培養陰性，但WMGS數據分析表明存在布魯氏菌[23]。NGS對微生物序列進行無偏倚的檢測，可以在一個單一的標準化通用檢測中鑒定所有病毒、細菌和真菌，從而為膿腫患者的快速病因學診斷提供了強大的支持[19，24]。長遠來看，該技術具有作為細菌培養、PCR或其他目前可用的檢測方法診斷膿腫病原菌的補充甚至替代的潛力。

2.4 血流感染

即使患者正在接受抗菌藥物治療，測序也可以檢測到病原體的DNA，這提高了mNGS用于診斷培養陰性的血流感染的可能性，如敗血癥、膿毒血癥等的診斷，且mNGS能識別更多的病原體[25-26]，特別是病毒感染，但是mNGS檢測到的病毒是致病性的還是攜帶的，目前尚無統一標準[27]。在疑似血流感染的危重患者臨床診斷中，微滴式數字PCR（ddPCR）方法有利于快速檢測常見的病原體和抗生素耐藥（antimicrobial resistance，AMR）基因，而mNGS檢測更適用于經典微生物或分子診斷方法無法檢出的血流感染致病病原體[28]。

2.5 眼部感染

自上世紀90年代末以來，病原體PCR等分子診斷技術已經改變了眼部感染的檢測方法[29]，NGS的出現亦引起了眼科學界的關注。在一項研究中，學者比較了宏基因組RNA測序（RNA-seq）和PCR檢測在診斷眼部感染方面的性能，發現使用RNA-seq可以準確地識別疑似眼部感染患者的房水和玻璃體樣本中的常見和罕見病原體，并鑒定菌株[29]；另一項研究發現宏基因組RNA深度測序（metagenomic deep sequencing， MDS）可以準確地檢測結膜炎的病原體，并在14%的病例中發現了Vittaforma角膜感染，突顯了其精準診斷的潛力[30]。RNA測序是高度無偏性的，因此可以檢測到PCR無法識別的病毒，并可以識別非病毒病原體，如肺炎支原體和沙眼球菌，但PCR可以識別RNA-seq檢測不到的一些DNA病毒[31]。MDS可以通過生物信息學分析未培養的微生物的DNA/RNA，已用于臨床診斷中微生物病原體的鑒定，其中包括眼前段和后段疾病如角膜傳染病和眼內炎，甚至用于眼內淋巴瘤[32]。NGS有可能改善眼部感染的診斷，但實際的臨床效用還需要更多額外的研究來證實。

2.6 其他感染

除了上述器官或系統，NGS還可以幫助檢出感染性心內膜炎患者切除的瓣膜中的病原菌[33]、胰腺炎患者外周血中的巨細胞病毒[34]等。這也提示臨床工作者，在診治疑似感染但傳統檢測為陰性或者懷疑是某些罕見感染的患者時，均可以考慮采用NGS的方法進行協助診療。但NGS目前還存在假陽性的問題，在全面檢測樣本中微生物的同時并不能區分某些微生物是致病菌還是定植菌。

3 局限性

高通量測序技術推動著精準醫療的發展，但也表現出了一定的局限性，比如mNGS在診斷肺外結核中的作用不及在急性感染性疾病中的作用。Zhang等[35]的研究表明，對于少菌型肺外結核桿菌感染的病例，mNGS檢出率較低，為了獲得更豐富的結核性病原菌信息，需要更高的測序深度，而超深測序帶來的巨大測序成本和分析時間遠遠超出了許多醫院的承受能力。另一方面，NGS技術目前仍缺乏統一的質量控制標準，存在假陽性率及假陰性率偏高、基因數據庫不完整、操作流程復雜繁瑣、低病原滴度水平樣本、檢測靈敏度低等問題，因此該技術尚不能作為常規檢測手段，只能作為傳統微生物檢測技術檢測病原體的一個重要補充方法。

4 結語

高通量測序技術的出現是測序技術的一大發展，它的進步與改良不斷適應著當下基礎、臨床以及公共衛生等領域的需求。盡管現有的報道和研究大多數為個案報道和小樣本量研究，NGS尚存在讀長較短、缺乏公認的判讀標準、測序結果與治療關系不明確等不足之處，但隨著測序技術及其應用在不斷發展，較大規模的比較驗證研究會更加完善，更多循證醫學證據完善后，高通量測序技術在病原體檢測中的臨床應用價值將得到進一步證實和提升。