外陰陰道念珠菌病病原體檢測方法研究進展

劉伊諾 姜偉偉 潘煒華

(海軍軍醫大學第二附屬醫院皮膚科 上海市醫學真菌分子生物學重點實驗室,上海 200003)

外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是一種由念珠菌感染引起的生殖道感染性疾病,是目前導致陰道炎的第二大常見病因,占17%～39%[1]。在我國,白念珠菌約占VVC致病菌種的70%～90%,是VVC的主要病原體,其次為光滑念珠菌,占4%～20%,克柔念珠菌、近平滑念珠菌和熱帶念珠菌也可引起VVC[2]。目前,直接鏡檢是臨床診斷VVC最常用的方法,但由于直接鏡檢敏感性較低,無法明確菌種,因此臨床亟需快速、準確的病原學檢測方法來提高VVC的早期、精準診斷。

2021年德國發布的一項指南指出[3],VVC確診需結合臨床表現和真菌鏡檢結果,鏡檢陰性時應進一步完善分泌物的培養鑒定。近年來,隨著分子生物學技術的不斷發展,DNA分子測序能夠快速、準確地將病原真菌鑒定至種的水平,其中ITS1/4等對念珠菌的鑒定敏感性高達90%以上[4]。本文結合目前已有研究對VVC病原體檢測方法進行綜述。

1 直接鏡檢

陰道分泌物涂片鏡檢是診斷VVC常用的實驗室檢測方法,鏡下查見卵圓形芽孢、孢子和/或假菌絲為陽性,但靈敏度欠佳,其準確率常與實驗室檢測人員的經驗密切相關。直接鏡檢陽性可作為確診VVC感染的重要指標之一,但缺點是不能將病原真菌精準鑒定至種的水平。真菌熒光染色可提高樣本檢測陽性率,使用液基真菌富集制片靶向熒光染色法能進一步降低對檢驗人員的要求,從而提高真菌鏡檢的準確率[5]。Momenzadeh等[6]研究表明,通過計算機輔助診斷軟件(computer-aided diagnosis software,CAD)處理顯微鏡圖像,能夠提高診斷準確率,節省診斷所需時間和成本。杜曉輝等[7]通過一種基于改進區域卷積神經網格(region-based convolutional neural networks,R-CNN)目標檢測算法實現了分泌物樣本顯微鏡圖像中念珠菌等有型成分的檢測,算法綜合檢測時間233 ms,為實現VVC感染的智能識別提供了理論基礎。周泉等[8]的一項研究表明,人工智能領域樣本稀釋機器人可以將待測樣本稀釋到適宜濃度,以便于檢驗人員觀察,從而提高VVC感染的診斷效率及準確率。

2 核酸檢測

2.1 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)

聚合酶鏈反應能夠在短時間內將目的基因與DNA片段進行快速擴增,PCR技術應用在VVC檢測的局限性主要在于缺少規范化的統一檢測標準和多中心的臨床研究驗證[9]。多重PCR可用于檢測多種細菌、毛滴蟲以及6種念珠菌等引起的陰道炎病原體,其敏感性和特異性達90%以上[1]。SeegeneAllplexTM是一種多重實時PCR檢測技術,可同時識別和定量7種微生物,用作念珠菌相關檢測時可自動將念珠菌屬分為白念珠菌和非白念珠菌(non-albicansCandida,NAC),檢測時長小于5 h。 Vieira-Baptista等[10]開展的一項750例單中心臨床診斷陰道炎的橫斷面研究表明,SeegeneAllplexTM對念珠菌的敏感性為91.1%,特異性為95.6%,其中對NAC的敏感性和特異性較高,分別為100%和97.5%。Aptima?CV/TV是一種基于轉錄介導擴增法(transcription-mediated amplification,TMA)而開發的檢測試劑盒,可用于檢測特定的念珠菌種屬,敏感性為85%～92%,特異性可達95%～99%[1]。

實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)最早由Higuchi等[11]提出,隨后美國PE(PerkinElmer)公司研發出了TaqMan熒光探針定量技術,真正實現了“即時檢測”。與傳統的PCR技術相比,熒光探針定量技術具有特異性高、可重復性好、操作簡單等優點。杜笠等[12]的一項研究報道顯示,實時熒光PCR定性法對生殖道念珠菌檢測的靈敏度和特異度分別為100%和97.45%,目前可用于白念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌等的檢測。

2.2 DNA探針法

DNA探針法以核酸雜交原理為基礎,對使用與病原體特有基因序列互補的兩個單鏈核酸探針(即捕獲探針和顯色探針)進行快速檢測。對于目標病原體,探針分析卡中分別包含一種單獨的微球,顯色探針包含在多孔試劑板中,將捕獲探針固定在嵌入探針分析卡的微球中。雜交完成后通過顯色試劑顯色確定是否存在病原體感染。該方法操作簡單,1 h內即可報告檢測結果,通過設定檢測念珠菌的陽性閾值,可有效避免念珠菌培養假陽性結果。2021年李韜等[13]的一項研究表明,應用BD AffirmTMVPⅢ DNA探針法檢測陰道念珠菌的靈敏度為82.26%,特異度為97.00%。在混合感染和疑難病例的檢測中BD AffirmTMVPⅢ DNA探針法有較高的臨床應用價值[14]。

2.3 環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是一種特殊的核酸檢測方法,在等溫條件下即可快速、特異地擴增DNA靶標。肖晶晶等[15]以白念珠菌RPSO基因為靶基因建立LAMP體系進行檢測,發現LAMP法對VVC病原體檢出的靈敏性和特異性分別為87.62%和88.33%,與PCR及分泌物的真菌培養有較好的一致性。2021年黃國亮等[16]研發了疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMAxx)和LAMP聯合的檢測方法和一種能夠量化陰道分泌物活菌的便攜式微流控芯片系統,用于評估抗真菌治療療效。

3 抗原檢測

免疫層析法(immunochromatography test,ICT)是一種基于免疫膠體金的技術,檢測流程僅需3 ～20 min[17]。首先將IgM單克隆抗體固定于硝酸纖維膜的某一區帶,當干燥的硝酸纖維素膜一端浸入加有標本處理液的分泌物標本后,由于毛細作用,標本沿著該膜向前移動,當移動至固定有抗體的區域時,標本中念珠菌的甘露聚糖表位抗原與該抗體發生特異性結合,通過免疫膠體金使該區域顯示相應顏色,從而實現特異性的免疫診斷。Marot-Leblond等[18]2009年研發了一款利用ICT快速檢測VVC的試劑盒,在其研究納入的205例患者中,ICT法的敏感度高達96.6%。莫翼軍等[17]對中國寧波市第一醫院的440份臨床樣本進行研究,發現ICT法的靈敏度為82.7%,高于鏡檢法(64.0%)。

4 其 他

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是近年來新興的一種新型的軟電離生物質譜,已廣泛應用于多肽、蛋白質、低聚核苷酸及低聚糖等,可作為替代生化和分子鑒定的可靠方法[19]。通過將培養得到的待測菌株的蛋白質譜圖與數據庫中已知真菌的參考譜圖對比后可得出鑒定結果,具有耗時短(3～5 min)、成本低、高通量、準確性高的特點,對念珠菌的特異性達90%以上[20]。MALDI-TOF質譜儀價格昂貴,但與現有技術相比,其高識別率有一定的應用價值[21]。

5 總結與展望

VVC是育齡期女性常見的生殖道真菌感染性疾病,嚴重影響患者身心健康。目前對陰道分泌物進行檢測的方法在傳統的鏡檢和培養基礎上有了新的發展和突破,核酸和抗原技術進一步提高了分泌物檢測的準確性,人工智能等先進技術的研發和應用可以使VVC病原體的檢測更加快捷和準確,能夠有效減少漏診和誤診率。在臨床篩查中,陰道分泌物鏡檢是首選檢測方法。當鏡檢無法明確或患者病情反復時可進行培養、核酸或抗原檢測。TMA、RT-qPCR、LAMP及ICT等檢測方法的應用實現了VVC的 “即時檢測”。綜上,加強VVC快速、準確、智能診斷方法的研究是其臨床防治的關鍵。