聚乙二醇修飾技術的應用研究進展

賈友彪,于鳳波,張雯慧,高俊霞,王 強

(牡丹江醫學院,黑龍江 牡丹江 157011)

聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG),經環氧乙烷聚合而成,是一種由重復的氧乙烯基組成的直鏈或具有支鏈的高分子化合物。PEG有2個末端羥基,具有線性的(相對分子量5 000～30 000)或支化的(相對分子量40 000～60 000)鏈狀結構。研究表明,PEG具有良好的水溶性,也可以溶于二氯甲烷、乙醇等多種有機溶劑,無毒,無免疫原性與抗原性,無致炎性,是一種生理惰性、安全的藥物輔料,同時具備抑菌性,是液體制劑的理性輔料,所以被美國FDA批準可作為體內注射藥用聚合物。PEG及其衍生物具有眾多的優良性質:無毒,免疫原性低,具有較好的生物相容性,并且由于PEG具有很多種不同分子量的分子,在化學、材料等方面的應用也十分廣泛[1]。

1 聚乙二醇的修飾

PEG修飾即PEG化(PEGylation),就是將高分子量的聚乙二醇聚合物通過共價鍵接入到另一個分子上,從而制備出在體內具備長循環功能的活性物質或是遞藥系統。PEG修飾的這一概念最初是由Davis和Abuchowski在1970年提出的,當時的PEG修飾主要集中在蛋白質化學修飾方面。他們以三聚氰胺為偶聯劑使甲氧基聚乙二醇與牛血清白蛋白共價連接,并發現改性后的牛血清白蛋白水溶性增加,不會與天然牛血清白蛋白的抗體發生反應被消除。與未改性的蛋白相比,改性后的牛血清白蛋白在溶解度、丙烯酰胺凝膠電泳遷移率、離子交換色譜和沉降等性能方面發生了顯著變化。

經過幾十年的發展后,PEG修飾技術逐漸成熟并應用于醫藥領域,活性物質或遞藥系統經PEG修飾后[2],(1)分子量會增加,降低藥物的腎臟清除率,有效延長藥物半衰期,增強藥物穩定性;(2)形成高分子隔斷層,阻斷血漿對納米制劑的吸附,可減少體內代謝酶對藥物的發現與降解;(3)溶解性提高;(4)毒性降低;(5)作用部位的血藥濃度波動減小,最大血藥濃度降低。

2 PEG修飾技術研究進展

2.1 PEG修飾技術在蛋白質、多肽類藥物中的應用蛋白質和多肽類藥物特異性高、安全性高、療效明確,但是在人體內易被酶發現降解,血漿中半衰期較短,因而致使很多藥物無法在臨床應用[3]。蛋白質和多肽類藥物通過PEG修飾后,可以改變其生物化學特性,減少藥物的腎臟清除率,保護其不被酶發現,增加其穩定性,延長半衰期,同時還可降低免疫原性和抗原性。

蛋白質、多肽的PEG化通常是指將活化后的PEG與蛋白質分子中的氨基、羧基或巰基進行偶聯,下面根據不同修飾位點分別介紹PEG的修飾方法。

2.1.1 氨基修飾 氨基修飾是最常用的PEG修飾方法,因為氨基具有較高的親核反應活性,且暴露在分子表面,易與PEG修飾劑發生化學反應。早期PEG修飾主要針對N-末端的α-NH2和賴氨酸的ε-NH2,應用較為廣泛的有PEG-琥珀酰亞胺碳酸酯(PEG-SC)、PEG-醛(PEG aldehyde)、PEG-琥珀酰亞胺琥珀酸酯(PEG-SS)等,此類修飾劑所需的反應條件較為溫和,對藥物的穩定性影響不大[4]。但是,PEG化氨基修飾的缺點也十分明顯,反應選擇性低,產物同分異構體數量多,難以分離純化得到單一的PEG化產物。隨著PEG修飾技術的發展,研究者們研究開發出多種方法來改良上述問題,比如改變反應條件,Shan-shan Ma[5]等人通過控制pH使用PEG修飾重組人白細胞介素-11突變蛋白(mIL-11),對賴氨酸殘基進行定點修飾,得到的PEG-mIL-11生物學活性未發生改變,改善了藥代動力學和藥效學等性質,最大血漿濃度增加了26倍以上,單劑量給藥作用持續時間與每天給藥7～10次的mIL-11一致。

2.1.2 羧基修飾 羧基是一種蛋白質側鏈上常見的化學反應基團,在二環己基碳二亞胺(DCCI)或1-乙基3-二甲氨基丙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)存在下,將PEG分子中的羧基轉化為氨基,再與蛋白質中的羧基發生縮合反應。N6,是一種從鉤蟲中分離的芳烴-3衍生物,本身具有較強的抗菌活性,但是對酶水解并且體內抗性較差,難以在臨床治療中應用[6]。Ting Li[7]等人使用PEG修飾N6的C-末端得到N6-COOH-miniPEG,與N6相比,修飾后的產物在胰蛋白酶中的穩定性更高;根據熒光分析,在0.75～2 h后,N6主要集中在腹腔處,而N6-COOH-miniPEG遍布全身各處,體內生物分布更加廣泛;在脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7細胞中,N6-COOH-miniPEG可使白細胞介素-10(IL-10)水平升高(37.83%),高于N6(-10.21%)。

2.1.3 巰基修飾 巰基具有較高的親核活性,在蛋白質、多肽分子中的含量極少,所以產物單一,容易分離純化。但是有游離巰基的蛋白質、多肽數量很少。因此,研究者們通過基因工程技術將巰基引入蛋白質、多肽的特異性位點,再用對巰基呈現一定活性的PEG進行定點修飾,常用的能與巰基特異性反應的PEG偶聯試劑主要有PEG-馬來酰亞胺(PEG-MAL)、PEG-鄰-吡啶二硫醚(mPEG-OPSS)、PEG-乙烯基砜(mPEG-VS)等。江辛琳[8]等人使用mPEG-MAL對β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)的第121位游離羧基進行修飾并篩選了實驗條件,得到產物β-LG-PEG,研究證明修飾后的蛋白結構發生部分去折疊,β折疊含量約降低7%,無規則卷曲含量約升高6%,內源熒光強度有所增強,抗原性顯著提升。

2.2 PEG修飾技術在小分子有機藥物中的應用近年來,研究者們發現很多小分子藥物也可以用聚乙二醇進行修飾,在大多數情況下,PEG與小分子藥物“不穩定結合”,在特定條件下水解釋放游離藥物發揮藥效,如喜樹堿(CPT)、紫杉醇(PTX)、多柔比星、表柔比星等,經修飾后的小分子藥物理化性質會發生改變,可以解決水溶性差、半衰期短、靶向性差、毒性大等缺點,使許多受到限制的小分子藥物有了新的發展前景。Wenhai Lin[9]等人成功合成了110 nm的穩定聚乙二醇化紫杉醇納米粒子(PEG-PTX NP),在3D平臺上研究PTX與PEG-PTX NP對鼻咽癌(NPC43)細胞行為的影響,結果顯示,PEG-PTX NP的藥物釋放更加穩定,細胞毒性更弱。

2.3 PEG修飾技術在遞藥系統中的應用傳統藥物存在半衰期短、靶向性差、對人體組織有毒副作用等缺點。將藥物分散在特殊的體系中,控制藥物在體內釋放的方式和速率以及地點,從而提高其療效和安全性,這種藥物制品被稱為藥物遞送系統[10](drug delivery system,DDS),又稱作新劑型或現代藥物劑型。功能性高分子化合物的研究是藥物遞送系統研究中的重要方向。目前,PEG修飾遞藥系統已經在臨床中獲得應用,具有廣闊的發展前景。

2.3.1 修飾納米粒 納米粒是將藥物吸附、連接或包裹于載體材料而制成的一種新型給藥系統,載體材料通常選擇天然聚合物或人工合成的高分子材料,比如卵磷脂、玉米醇溶蛋白、白蛋白、聚乳酸、環糊精等[11]。修飾后的納米粒經給藥進入體內,不易被內皮網狀組織(RES)識別并攝取,延長了體內循環時間,使藥物集中在作用部位,改善藥物的體內分布,減輕了對正常組織的損害。Ling Zhang等人[12]以殼聚糖為載體材料,進行PEG修飾并包載環孢霉素A,評價了其藥代動力學和藥效學。實驗結果顯示,納米粒的生物半衰期是環孢霉素A溶液的21倍,PEG修飾大大延長了環孢霉素A在體內的循環時間,提高了其生物利用度。

2.3.2 修飾脂質體 脂質體是指將藥物包封在磷脂雙分子層、膽固醇等仿生膜結構中,對水溶性藥物和脂溶性藥物都有較好的負載效果。當脂質體作為藥物載體時,具有淋巴系統趨向性,可被單核巨噬細胞攝取,并通過細胞內吞和融合作用,直接將藥物送入細胞內,對肝、脾等組織具有靶向性[13];對脂質雙分子層進行修飾,加入抗體、受體配體和糖殘基可以使其主動靶向至作用部位;向其加入特殊脂質和磁性材料,可使藥物物理靶向至作用部位。尿石素A(Uro-A)是哺乳動物腸道中鞣花單寧的代謝產物,具有抗氧化,抗炎和抗腫瘤作用。但是,Uro-A的水溶解度低,半衰期短,極大限制了其臨床應用。Yi Shengfu等人[14]首次制備了負載Uro-A的聚乙二醇化脂質體(Uro-A-PEG-LPs),并對其理化性質和體外抗腫瘤效果進行了評價。結果表明,Uro-A-PEG-LPs的穩定性提高,可在4 ℃下長期穩定儲存,半衰期是普通游離Uro-A水溶液的4.58倍,延長了體內循環時間,增強了抗腫瘤療效。

2.3.3 修飾膠束 膠束是指兩親性的嵌段聚合物在水溶液中溶解并自組裝形成的核-殼結構制劑,可以有效避免分解變性,延長在體內的循環時間,降低藥物毒性。膠束的制備方式主要有物理包載、化學結合、增容法以及聚離子復合法,物理包載通常載藥量低、穩定性差,而化學結合往往更加穩定。賈李瑛[15]等人鍵合伊替立康活性代謝物SN38與PEG得到PEG-SS(O)-SN38,使用薄膜分散法得到制成自組裝膠束。結果顯示,膠束具有一定的緩釋效果,在模擬的生理條件下穩定性良好,與相同劑量的鹽酸伊立替康注射液相比,自組裝膠束對人胰腺癌(Capan-1)瘤裸小鼠具有明顯的腫瘤抑制作用。

2.3.4 修飾樹枝狀聚合物 樹枝狀聚合物(Dendrimer)是一種具有高度枝化結構的大分子,合成方法主要有發散合成法、收斂合成法、發散收斂共用法和固相合成法。樹枝狀分子具有低粘度、內部空腔大、納米級尺寸、結構精確可控、表面分布大量官能基團等特點,使其在生物醫藥、催化劑及光電功能材料等領域受到人們廣泛的關注。使用PEG修飾樹枝狀分子作為藥物載體,可以顯著提高包封率、載藥量以及穩定性,同時可以延長藥物的血漿循環時間,降低藥物對正常組織的毒性,減輕治療過程中的副作用[16]。聚酰胺胺樹枝狀大分子(PAMAM)可以促進口服藥物的吸收,但其結構上的胺基與細胞膜相互作用會導致細胞膜毒性,抑制了其在臨床應用中的發展,高堯春[17]對PAMAM進行PEG修飾得到PAMAM-PEG聚合物,結果表明,PAMAM-PEG無明顯毒性作用,可促進腸道吸收過程,提高化合物的口服生物利用度。

3 PEG面臨的問題

3.1 過敏目前,在PEG臨床應用中,過敏反應是常見的副反應之一,PEG在體內產生的副產物可能會引發不良反應,導致超敏反應(hypersensitivity reactions,HSR)的發生。Fionnuala Cox[18]報告了6例急性PEG超敏反應,因此,在PEG的臨床使用中,需要對其進行早期識別,提高使用安全性。聚乙二醇(PEG)是新冠病毒疫苗中的輔料之一,輝瑞公司的新冠病毒疫苗發生過幾起嚴重過敏事件,主要原因就是患者對PEG過敏。

3.2 加速血液清除(ABC)加速血液清除(ABC)現象是PEG的一種潛在免疫反應。一直以來,人們都認為PEG化脂質體沒有免疫原性。但是,研究者們發現向同一動物體內重復注射PEG修飾的納米制劑時,藥代動力學會發生改變,這是因為多次注射誘導產生了PEG特異性的IgM抗體,重復注射的制劑會喪失其長循環特性,血液清除速度加快,在肝和脾的聚集量增加[19]。

3.3 不可生物降解性PEG的另一個缺點是它的不可生物降解性,高分子量綴合物的PEG修飾后的藥物在體內停留時間增加,會導致藥物在肝臟中積累,從而引起大分子綜合征[2]。PEG在體內主要由腎臟清除,但是目前沒有研究準確計算出腎臟可清除PEG的精確分子量。

3.4 不穩定性當PEG為固態和在溶液中加熱時具有不穩定性,都會發生降解,經研究者試驗,100 kDA的固體PEG在60 ℃的空氣中放置一個月后,MW減少了10倍[20]。PEG被機械應力、氧氣、水和能量等因素刺激后,還會發生化學反應導致PEG的降解。

3.5 阻礙藥物攝取率在基因遞送系統中,PEG修飾會中和遞藥系統表面的zeta電位,從而提高它的分散性和水溶性等性質并降低基因載體的毒性,但是PEG有時會起到阻擋的作用,降低基因遞送載體的細胞攝取和轉染效率,所以在一定程度上,PEG可能會阻礙藥物攝取并降低其療效。

3.6 漢族人體陽性率問題近年來有研究表明,PEG化脂質體會誘導抗-PEG抗體的產生,這種抗體會和PEG制劑結合,從而激活相關假變態反應(complement activation related pseudo allergy,CARPA),引起機體的免疫應答,患者臨床表現為呼吸困難、胸痛、低血壓或高血壓以及心臟疼痛。而且據相關文獻表明,健康漢族人血液內的抗-PEG抗體陽性檢測率遠高于其他種族[21]。

4 替代

4.1 聚甘油(PG)Michael Tully等人[22]選擇用PG-蛋白偶聯物修飾治療性蛋白阿那白滯素(IL-1ra,Kineret)的N-末端,同時用分子量相同的PEG進行修飾設計對照實驗,得到PEG-anakinra和PG-anakinra。兩種綴合物的流體動力學性質和二級結構相差不大,對IL-1ra的結合親和力都隨著聚合物長度的增加而降低。與未修飾的蛋白質相比,40 kDa的PG-anakinra的半衰期延長了4倍,與PEG-anakinra的半衰期相同。研究結果表明,兩種綴合物的性能相差不大,所以PG在藥物半衰期延長方面具有較大的發展前景。

4.2 聚肌氨酸(PSar)Yali Hu等人[23]報道了一種非離子型親水多肽聚肌氨酸(PSar),并使用其修飾人干擾素-α2b(IFN)的N-末端,將得到的PSar-IFN與PEG干擾素結合物(PEG-IFN)進行系統的比較。研究發現,與PEG-IFN相比,在體外,PSar-IFN的活性更強;在體內,PSar-IFN可以有效的抑制腫瘤生長,并且在小鼠體內引發更少的的抗IFN抗體,不會出現ABC現象。所以這種多肽在生物醫學應用中具有巨大的潛力。

4.3 聚山梨酯80(PS80)阿斯利康新冠病毒疫苗中的賦形劑是聚山梨酯80(PS80),Priya Sellaturay等人[24]根據聚乙二醇和聚山梨酯的組成和皮膚試驗數據,提出了聚乙二醇和聚山梨酯之間的交叉反應性。實驗選中8例在劍橋大學醫院過敏門診確診的PEG過敏患者,患者在接種疫苗前接受了PS80(20%)和阿斯利康COVID- 19疫苗的皮膚點刺試驗。結果顯示8例PEG過敏患者均耐受阿斯利康新冠病毒疫苗。結果表明,對PEG過敏的患者,可以安全接種阿斯利康含有PS80的疫苗。

5 展望

近年來,藥品的PEG修飾技術發展十分迅速并取得了突破性進展,從實驗室階段走入產品開發及臨床應用,國外許多PEG修飾的藥品也不斷上市,為人類對抗疾病提供強有力的手段。雖然PEG修飾技術仍然存在很多問題,但是PEG修飾仍然是改善藥物藥代動力學和藥效學的首要選擇。目前,研究者們仍很難找到可以完全取代PEG的替代品。PEG修飾技術在遞藥系統中仍發揮著不可或缺的重要作用,如何去除PEG化制劑的ABC現象是目前臨床應用中的難點和研究熱點,研究者們應該更全面的去了解納米制劑清除系統,探討如何防止或延緩納米制劑的清除,減少ABC現象的發生,使PEG化在臨床治療獲得更多突破性的進展。