不同培養條件對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

賁海燕，郝永娟，霍建飛，姚玉榮，王萬立

（天津市農業科學院植物保護研究所，天津 300384）

草莓白粉病病原菌為真菌子囊菌亞門單囊殼屬羽衣草單囊殼菌（Sphaerotheca aphanis），為專性寄生菌。我國于1959 年首次在原沈陽農學院溫室草莓上發現白粉病[1]。近年來國內草莓白粉病害愈發嚴重，尤其是保護地草莓白粉病，從苗期到果實成熟期不間斷發生，特別是適宜采摘的‘紅顏’‘章姬’等品種對草莓白粉病較為敏感，設施栽培重茬連作棚架及土壤中病原菌積累，以及棚室通風透光性差、種植密度大，棚內適溫高濕等原因，致使草莓白粉病發病早且重，一般減產20%～30%，重則減產可達50%、甚至絕收，嚴重影響了草莓的產量和品質[2]。天津地區多為鹽堿地，草莓不耐鹽堿，管理不到位，植株生長受阻很容易發生白粉病。目前，對草莓白粉病病原菌的研究報告較少[3-4]，針對草莓白粉病菌生物學特性的研究更是鮮見報道，為進一步明確草莓白粉病菌分生孢子生物學性狀，本研究在室內對分生孢子在不同溫度、濕度、光照、碳源等條件下的萌發率、芽管長度進行研究，以期為草莓白粉病流行規律研究、藥劑篩選及病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草莓白粉病菌（Sphaerotheca aphanis(Wall.)Braun）為天津市農業科學院植物保護研究所蔬菜病害室采自感病品種純化后活體保存的菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 pH 值對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響 在無菌條件下，用滅菌解剖刀切下約4 cm2的2%水瓊脂培養基塊，置于載玻片上。將草莓病果表面的新鮮白粉病菌用滅菌毛刷刷至pH 值分別為4、5、6、7、8、9、10 的無菌水溶液內，取10 μL 滴在水瓊脂塊表面，蓋上蓋玻片，將載玻片置于有濕潤濾紙的培養皿內，每組處理3 次重復。將培養皿置于25 ℃培養箱中黑暗培養，分別在0、18、24、48 h 取出，并用光學顯微鏡觀察分生孢子的萌發情況：芽管長度超過分生孢子短徑的1/2 記為萌發，于20×10 倍顯微鏡下觀察統計分生孢子萌發數，每視野40～50 個分生孢子，隨機取5 個視野統計分生孢子的萌發率并測量芽管長度。

0 h 為試驗處理前初始孢子萌發率（以下同）。為準確的表示各處理真實的孢子萌發情況，處理前需統計已萌發的孢子數量，即0 h 觀察記錄的初始孢子萌發數量，再分別用培養18、24、48 h 的孢子萌發率減去未處理的初始萌發率作為最終的萌發率結果。

1.2.2 碳源對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響 配制2%葡萄糖培養基（每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 葡萄糖）、2%蔗糖培養基（每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 蔗糖）、2%果糖培養基（每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 果糖）、2%淀粉培養基（每100 mL 2%水瓊脂中加入2 g 淀粉）；用新鮮草莓果肉搗碎、紗布過濾，獲得草莓煮沸汁液備用。采用瓊脂培養法，在無菌條件下，將各處理培養基融化后，倒入滅菌培養皿中一薄層（厚度約為2～3 mm），待凝固后用滅菌解剖刀切下約4 cm2的培養基小塊，置于載玻片上，并將事先準備的草莓白粉病果上的霉層直接蘸取到培養基表面上待用。

試驗設6 個處理，以只加蒸餾水的2%水瓊脂玻片為對照，各處理培養基蘸取白粉病菌霉層后分別進行如下處理：①2%葡萄糖培養基滴加10 μL 蒸餾水；②2%蔗糖培養基滴加10 μL 蒸餾水；③2%果糖培養基滴加10 μL 蒸餾水；④2%淀粉培養基滴加10 μL 蒸餾水；⑤2%水瓊脂培養基滴加10 μL 草莓汁煮沸液；⑥2%水瓊脂培養基滴加10 μL 蒸餾水（CK），各處理完成后蓋上蓋玻片。每組處理3 次重復。培養條件同1.2.1，于0、18、24、48 h 取出鏡檢，隨機取5 個視野統計孢子萌發率并測量芽管長度。

1.2.3 不同光照條件對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響 取10 μL 白粉病菌孢子懸浮液（濃度為1×105個孢子·mL-1，pH 為7）接種于2%葡萄糖培養基玻片上，分別進行24 h 黑暗、24 h 光照、12 h 黑暗-12 h 光照3 個處理，每處理3 次重復，在溫度為25 ℃、相對濕度100%的培養箱中培養。萌發率統計同1.2.2。

1.2.4 溫度對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

（1）不同溫度對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響。取孢子濃度為1×105個孢子·mL-1的懸浮液10 μL，接種于2%葡萄糖培養基玻片上，分別置于5、15、20、25、30、35 ℃，相對濕度100%、全光照的培養箱中培養24 h，每處理3 次重復，于0、18、24、48 h取出在顯微鏡下觀察，隨機取5 個視野統計分生孢子萌發率并測量芽管長度。

（2）草莓白粉病菌分生孢子致死溫度測定。刷取發病草莓葉片上白粉病菌制成pH 為7、孢子濃度為1×105個孢子·mL-1的孢子懸浮液，分別置于35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45 ℃的水浴鍋中，懸浮液達目標溫度后保持恒溫水浴10 min 后，取10 μL接種于2%葡萄糖培養基玻片上；對照不進行水浴處理，在溫度為25 ℃、相對濕度100%的光照培養箱中培養，以上處理均重復4 次。分別在0、24 h 時取出，于20×10 倍顯微鏡下觀察統計分生孢子萌發數，芽管長度超過分生孢子短徑的1/2 記為萌發，每視野40～50 個分生孢子，隨機取5 個視野統計孢子萌發率。

1.2.5 濕度對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響利用飽和鹽溶液使干燥器的相對濕度分別控制在100%、92%、81%、67%、52%、34%、20%共7 個處理，將10 μL、孢子濃度1×105個孢子·mL-1的菌懸液接種于2%水瓊脂玻片上，置于不同相對濕度的干燥器中，密閉后25 ℃、全光照培養，分別在0、18、24、48 h 取出鏡檢，每個處理3 次重復。萌發率和芽管長度統計同1.2.2。

1.3 統計分析

使用Excel 2010 和SPSS 22.0 對試驗數據進行統計分析，采用Duncan’s multiple range test 進行多組樣本間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 pH 值對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

由圖1 可知，草莓白粉病菌分生孢子在pH 值5～10 下均有不同程度萌發。當培養18 h，在pH 值6～8 處理環境下，分生孢子整體萌發率高于其他處理；隨著培養時間的延長，各處理孢子萌發呈上升趨勢。培養48 h 后，pH 值為7 的孢子萌發率最高，值為44.7%，其次是pH 值為8 的處理值為26.4%，pH值為5 和10 處理的孢子萌發率最低，僅為2.2%～2.6%，而pH 值為4 處理，未見孢子萌發。

圖1 pH 值對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

由圖2 可知，酸堿環境對孢子芽管長度的影響存在差異，其中pH 值為7 和8 環境培養18 h 的芽管長度顯著長于其他處理，且各處理芽管長度與培養時間呈正比。當培養48 h 時，pH 值為7 處理的芽管長度最長達484.25 μm，且偏堿性環境下更有利于芽管伸長。以上結果表明，pH 值為6～8 的環境條件下更有利于草莓白粉病菌分生孢子的萌發及芽管的生長，最適pH 值為7。

圖2 pH 值對草莓白粉病菌芽管伸長的影響

2.2 不同碳源條件對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

由不同碳源條件培養草莓白粉病菌分生孢子的試驗結果（圖3、圖4）可知，各處理的孢子萌發率、芽管長度與培養時間呈正相關。各處理對孢子萌發的影響存在顯著差異（圖3）。培養18 h 后，草莓汁煮沸液的萌發率最高，其次是2%葡萄糖培養處理，顯著高于2%淀粉培養基和2%果糖培養基的萌發率；隨著培養時間延長萌發率上升，當培養48 h，2%葡萄糖培養基處理的萌發率最高達47.96%，此時草莓汁煮沸液和2%蔗糖培養基培養處理的孢子萌發率也能達到39.07%和36.53%，明顯高于水瓊脂對照處理的萌發率，而2%果糖和2%淀粉處理對孢子萌發抑制作用顯著，低于對照處理的萌發率。

圖3 不同碳源條件對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

由圖4 可知，各處理芽管萌發長度與培養時間呈正相關。培養18 h 后，以蔗糖為碳源處理的孢子芽管長度最長，平均值達（260.9±6.4）μm；隨著培養時間的延長，以葡萄糖為碳源處理的芽管長度迅速增長，培養24、48 h 的芽管平均長度分別為（350.8±9.6）μm 和（500.7±10.1）μm，蔗糖處理次之，顯著長于對照處理及其他處理；以草莓果汁、果糖、淀粉為碳源的處理對芽管伸長有一定抑制作用，與對照處理相比，芽管生長緩慢，培養48 h 的芽管平均長度分別為（191.0±2.4）μm、（167.0±4.9）μm 和（140.6±6.0）μm，與對照處理相比，芽管長度短了（160.1～210.4）μm。由此可見，草莓白粉病菌分生孢子在以葡萄糖為碳源的條件下有較強的適應性。

圖4 不同碳源條件對草莓白粉病菌芽管萌發的影響

2.3 不同光照條件對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

將結果進行差異顯著性分析，結果表明不同光照條件對孢子萌發的影響存在顯著差異。由圖5 可知，連續24 h 光照處理的孢子萌發率顯著高于連續24 h 黑暗處理的萌發率，光照處理組的萌發率可達44.40%；24 h 黑暗處理的孢子萌發率顯著高于12 h黑暗-12 h 光照處理的萌發率。由圖6 可知，24 h 光照處理與24 h 黑暗處理的孢子芽管長度差異不顯著，但顯著長于12 h 黑暗-12 h 光照處理組。

圖5 光照對草莓白粉病菌孢子萌發的影響

圖6 光照對草莓白粉病菌孢子芽管長度的影響

2.4 溫度對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

2.4.1 不同溫度對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響 由不同溫度對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響的試驗結果（圖7）可知，不同培養溫度對孢子萌發有顯著影響。培養18 h 后，25 ℃培養條件下，孢子萌發率為20.41%，顯著高于其他處理；10、15、35 ℃條件下，對孢子萌發抑制作用明顯，萌發率為1.26%～2.15%；5 ℃條件下，未見孢子萌發。隨著培養時間的延長，15～30 ℃培養處理的孢子萌發數量逐漸增多，其中25 ℃培養處理的孢子萌發率增幅最大，培養48 h 的孢子萌發率達44.13%，其次是20、30 ℃培養處理，萌發率分別為28.42%、20.7%；而5、10、35 ℃培養處理的孢子萌發受限，萌發率在3.14%以下。

圖7 溫度對草莓白粉病菌孢子萌發的影響

不同溫度條件下，草莓白粉病菌的芽管長度明顯不同。整個培養過程中，25、30 ℃條件下，芽管長度較長，培養48 h 的芽管長度分別為481.18、472.98 μm，顯著長于其他溫度處理；其次是20 ℃條件下，培養48 h的芽管長度為410.27 μm；而5～15 ℃及35 ℃條件下芽管伸長受到抑制，培養48 h 的芽管長度在274.64 μm 以下。

圖8 溫度對草莓白粉病菌芽管長度的影響

2.4.2 草莓白粉病菌分生孢子致死溫度的測定從表1 結果能夠看出，35、36 ℃培養處理24 h 的孢子萌發率已經很低，萌發率僅為2.79%～3.16%；隨著溫度升高，萌發率降低，當溫度為41 ℃時萌發率幾乎接近于零，但仍有2 次重復的顯微鏡觀察視野中有零星萌發的孢子，而42 ℃及以上溫度處理，孢子未見萌發，完全受到抑制。以上結果說明，42 ℃為草莓白粉病菌致死溫度的臨界溫度。

表1 不同溫度處理對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

2.5 濕度對草莓白粉病菌分生孢子萌發的影響

由試驗結果（圖9）可知，不同相對濕度處理對草莓白粉病菌分生孢子的萌發有顯著影響，且各處理之間的差異較大。培養18 h 后，相對濕度為92%的處理萌發率最高達22.04%，與相對濕度為100%處理的萌發率相當，顯著高于其他處理；隨著培養時間的延長萌發率整體呈現上升趨勢。培養48 h 后，相對濕度為92%、100%的處理萌發率分別達37.35%、40.88%，而相對濕度為20%～67%的處理萌發率為5.11%～15.80%，對白粉菌孢子的萌發抑制作用明顯。

圖9 濕度對草莓白粉病菌孢子萌發率的影響

不同濕度環境下草莓白粉病菌的芽管長度顯著不同（圖10），整個培養過程中相對濕度92%～100%的芽長度明顯長于其他處理，培養18 h 的芽管長度分別為386.93、397.74 μm；隨著培養時間增加，芽管逐漸伸長，其中相對含水量81%～100%的芽管增長幅較大，培養48 h 芽管長度為408.75～437.99 μm，其次是相對濕度52%～67%，而相對濕度20%～34%的芽管伸長顯著受到抑制，長度分別為283.99、289.60 μm。

圖10 濕度對草莓白粉病菌芽管長度的影響

3 討論與結論

草莓白粉病是設施草莓栽培的主要病害，草莓白粉病病原菌為Sphaerotheca aphanis，楊俊譽等[2]通過DNA 分子檢測，證實S.aphanis 與P.aphanis 的同源性為100%；Pei 等[5]首次報道華中地區的草莓白粉病菌為Golovinomyces orontii。本研究采用的白粉病菌是由草莓果實上采集保存而來，通過形態學和分子生物學方法鑒定為羽衣草單囊殼菌Sphaerotheca aphanis。國內關于草莓白粉病菌的報道多見于發生情況與防治技術方面，如王偉群等[3]、王璐等[4]報道了田間草莓白粉病發生的影響，而目前未見其生物學特性方面的研究[6]。本研究擬通過對草莓白粉病菌分生孢子萌發條件的摸索，為草莓白粉病的物理和化學防治提供新思路。接種初期孢子能否萌發對接種成功有著至關重要的作用，對品種抗病性鑒定、室內藥劑篩選均有影響[7-9]。草莓白粉病菌分生孢子萌發的條件中，溫度與其他單囊殼白粉菌基本相似[10-12]，分生孢子萌發最適溫度為25 ℃，溫度過高或過低均會導致分生孢子萌發率下降，筆者在研究中發現，當溫度低于10 ℃或高于35 ℃以上，草莓白粉病菌孢子活性受到抑制，萌發率大幅降低，芽管伸長也受到限制，當溫度高于42 ℃處理10 min，孢子停止萌發。因此，在草莓白粉病預防中，在晴朗天氣持續進行高溫悶棚，使棚室溫度達到42 ℃以上孢子致死高溫，可抑制白粉病菌分生孢子的萌發，從而控制白粉病的發生。相對濕度為81%～100%的高濕環境有利于草莓白粉病菌孢子的萌發和芽管的伸長，濕度越大越有利于孢子萌發侵染，而低濕度環境對孢子萌發、芽管伸長抑制作用明顯。環境pH值也是影響白粉病菌孢子萌發的重要因素，通常白粉病菌分生孢子的酸堿度適應范圍較廣?？喙习追鄄》稚咦用劝l最適pH 值為5～9[13]、煙草白粉病病原菌在pH 值5～8 內的萌發率較高[14]，番茄白粉病病原新番茄粉孢菌在pH 值為3～12 的條件下分生孢子萌發率較高[15]。本研究發現，草莓白粉病菌分生孢子在pH 值為6～8 的環境下萌發率相對較高，且弱堿環境的孢子萌發率高于酸性環境的萌發率。當pH 值為7 時，最適合孢子萌發及芽管伸長。因此，噴施中性水，使草莓植株處于中性環境條件，更有利于草莓白粉病菌的擴繁、傳播，以及病原菌活體保存。而pH 值在5 以下或pH 值為9 以上的酸堿環境對草莓白粉病菌孢子萌發抑制作用明顯。白粉病菌對光照敏感性差異較大，苦瓜白粉病菌分生孢子萌發最適條件是全黑暗[13]，煙草白粉病菌受光照時長的影響差異不大[14-16]。完全光照條件下，更有利于草莓白粉病菌的孢子萌發，萌發率顯著高于完全黑暗及黑暗-12 h 光照處理的萌發率，而孢子芽管長度受完全光照或完全黑暗處理的影響差異不顯著。在營養物質的利用方面，草莓白粉病菌更喜歡利用葡萄糖促進其孢子萌發及芽管伸長，而在以果糖和淀粉為碳源的條件下草莓白粉病菌的適應性較差。

草莓白粉病菌分生孢子萌發的最適溫度、致死溫度分別為25 ℃、42 ℃，喜高濕、中性環境，喜葡萄糖，光照有利于草莓白粉病菌分生孢子萌發。因此，生產中可降低棚室內相對濕度，保持葉片、果實表面無水滴等防治草莓白粉病。生產空閑期間，選擇晴朗的高溫天氣進行高溫悶棚，關閉通風口充分密閉棚室，使土壤及棚室內環境溫度達到病原菌致死高溫，充分切斷內部傳染源，從而達到物理預防和控制的目的[17-18]。