室性早搏對心室肌線粒體超微結構的影響*

楊曼琪 吳鋼 劉韜 崔博 居昊 劉哲宇 任宗力 曹省 顏敏 張帆

室性早搏(PVC)是一種常見的室性心律失常。越來越多的臨床證據表明有的頻發性PVC會引起心臟結構和功能變化,引起PVC 心肌病(PVC-ICM)[1],但PVC-ICM 的具體機制尚不完全清楚。線粒體作為人體重要的代謝工廠,其穩態對細胞活性至關重要[2]。越來越多研究發現,線粒體異常與心臟疾病關系密切,如心力衰竭、心肌梗死、擴張型心肌病以及糖尿病性心肌病等[3－5]。而線粒體異常是否與PVC-ICM 有關尚不清楚,筆者通過建立PVC-ICM 犬模型,觀察犬心功能變化及線粒體超微結構,以探索PVC-ICM的機制,為臨床PVC-ICM 患者的遠期恢復尋求新的潛在線索。

1 材料與方法

1.1 動物分組

14只成年比格犬(體重10～12 kg/只)購自武漢大學人民醫院實驗動物中心,隨機分為對照組(CTL,n＝7)和模型組(PVC-ICM,n＝7)。實驗設計和實施均通過武漢大學人民醫院實驗動物福利倫理委員會審批(WDRM20201007)。

1.2 PVC-ICM 模型的制作

1.2.1 在全身麻醉下,14 只比格犬接受了起搏器的植入。無菌準備后,切開右側頸部,暴露頸外靜脈,在X 線透視下將兩根雙極起搏電極送入右室。將心房電極置于右室游離壁,心室電極植于右室心尖部(圖1 A)。心房電極與雙腔起搏器(Insync III,Medtronic,Minneapolis,MN)的心房端口(atrial port)相連接,用于感知竇性心室波,心室電極與起搏器心室端口(ventricular port)相連接,用于起搏心室。設置起搏參數,心室感知5 m V,起搏閾值1 V,起搏電壓設置為2 V。啟動起搏器,確認成功感知自身竇性心律和起搏右室后,固定電極并關閉起搏器。將起搏器置于頸外側囊袋中,縫合頸部傷口。由于起搏器數量有限,我們分3 批給犬植入起搏器,第一批:3 只CTL組和3只PVC-ICM 組;第二批:3只CTL組和3只PVC-ICM 組;第三批:1只CTL組和1 只PVC-ICM 組。

圖1 安裝起搏器后犬胸部X 線影像側位圖及PVC程序程控前后犬心電圖的變化

1.2.2 參數設置 手術完成1周后,PVC-ICM 組將起搏器設置為VDD 模式。電極1感知到竇性心律后,由電極2提前釋放一次早搏刺激,通過這種方式模擬起源于右室心尖的持續二聯律PVC。通過調節電極1 感知竇性心室波后與電極2 釋放電沖動之間的時間間隔(即起搏器房室延遲時間)來模擬PVC與前次竇性心室波的聯律間期(CI),CI固定為350 ms。犬基礎心率為120分/次,竇性搏動周長為500 ms,故而設置CI長度為竇性周長的75%,即350 ms。每2周對犬進行1次心電圖監測,觀察心電圖以確定起搏器持續有效起搏。CTL 組犬起搏器不啟動程序。

1.3 超聲心動圖評估心功能

于基線及PVC 程控起搏開始后每2周對各組動物進行一次超聲心動圖檢查(Vivid E9,GE,US)。測量左室射血分數(LVEF)、短軸縮短率(FS)、左室舒張末內徑(LVEDD)、左室收縮末內徑(LVESD)、左室后壁厚度(LVPWT)、舒張末期室間隔厚度(IVST)。每次超聲心動圖檢查前關閉起搏器至少15 min,以獲得準確的參數。

1.4 透射電子顯微鏡

犬造模結束后,注射過量戊巴比妥鈉將犬處死,取部分心室游離壁組織,切割成1 mm3大小的立方體,固定于2.5%的戊二醛中,4℃保存2 h至完全固定,1 mmol/L 的磷酸緩沖液沖洗,1%四氧化俄固定4℃2 h,包埋于環氧樹脂中,包埋液固化,醋酸鈾染色后于透射電鏡(JEOL JEM1200EX,日本電子公司)下進行拍照分析。使用ImageJ軟件(NIH)測量線粒體的大小、面積和數量。

1.5 統計分析

所有統計檢驗均使用GraphPad Prism 軟件(La Jolla,CA)進行。計量資料采用均數±標準差(±s))表示,兩組間比較采用t檢驗。計數資料用率表示,采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 一般情況

整個造模期間,CTL 組犬精神狀況良好,總體情況無明顯變化;PVC-ICM 組在造模后期有5只犬陸續出現進食減少,活動量少,精神萎靡等癥狀。

2.2 兩組超聲指標的比較

與CTL 組 相 比,PVC-ICM 組 起 搏12 周 后,LVEF和FS顯著降低,LVESD 和LVEDD 增加(P＜0.05),見表1。

表1 12周后2組犬的心臟超聲指標

2.3 線粒體超微結構的比較

與CTL 組比較,PVC-ICM 組起搏12周后,心肌細胞呈不規則形狀,心肌間質有膠原沉積,線粒體形態不規則,網絡結構融合,并表現出異常的嵴(圖2);每個顯微視野下線粒體數量減少[(93.29±6.02)個vs(112.43±11.85)個,P＜0.001],體積增大[(2.42±0.18)μm2vs(1.54±0.19)μm2,P＜0.001],每個視野下線粒體面積增大[(225.63±18.88)μm2vs(171.37±19.64)μm2,P＜0.001]。

圖2 12周后2組犬線粒體超微結構變化的比較

3 討論

本研究通過建立PVC-ICM 犬模型,主要發現:①頻發性PVC可導致心功能障礙。②頻發性PVC會導致線粒體超微結構改變,包括線粒體數量增多,體積增大,線粒體嵴融合。

2011年,Huizar等[6]首次采用右室心外膜起搏方案成功建立PVC-ICM 模型,在他們的研究中,模型組觀察到左室功能障礙,這與本研究結果一致。除此之外,Huizar等使用Masson染色在光鏡下并未觀察到心肌間質纖維化改變,而本研究使用電鏡發現心肌間質有膠原沉積。造成這種差別的原因可能是因為Huizar等采用的觀察儀器是光鏡,而本研究采用電鏡,觀察的結果更加細微。也有可能是因為Huizar 等的模型采用的是短聯律間期(CI＝250ms)起搏模式,而本研究的模型采用的是長聯律間期(CI＝350ms)起搏模式。已有多項臨床研究發現長CI是PVC-ICM 的危險因素,CI延長,患者患PVC-ICM 的 風 險 越 大[7－8]。2016 年Tanaka等[9]通過心內膜起搏方式在豬身上建立CI為320ms的PVC-ICM 模型,除了發現模型組心功能障礙,還發現心肌間質明顯的纖維化,這與本研究結果一致。心肌纖維化改變可能是部分患者抑制PVC 后心功能不能恢復的一個原因。

正常情況下,線粒體通過氧化磷酸化產生三磷酸腺苷,為心肌細胞的正常收縮和代謝提供能量,維持細胞穩態[10],心肌細胞的病理生理學與線粒體的變化有關,包括腫脹、嵴膜喪失、結構變形或心室內外空泡[11],故而線粒體形態和功能的穩定性對于維持正常的心臟生理功能尤為重要。Ashrafian等[12]在Dnm1突變的小鼠模型中觀察到與線粒體復合體水平降低、心臟三磷酸腺鞋苷(ATP)耗盡和心力衰竭相關的線粒體網絡延長,首次證明參與線粒體重塑的基因缺陷可能導致心肌病。Abdullah等[13]同樣發現線粒體異常與心功能障礙有關。在本研究中,PVC-ICM 組線粒體數量增多、形態不規則、結構紊亂,網絡結構融合,這表明線粒體異?？赡苁荘VC-ICM 的一個原因。

頻發性PVC 導致心室線粒體超微結構損傷的機制目前尚不清楚,筆者猜測可能與線粒體Ca2＋超載有關。Walters等[14]在豬模型中發現,相較于對照組,PVC-ICM 組磷酸化的蘭尼堿受體2(p-RYR2)、鈉鈣交換器-1(NCX-1)、鈣依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)的蛋白水平均上調。Ca MKⅡ對心肌細胞Ca2＋穩態發揮重要的調節作用,其過度激活可對L 型Ca2＋通道(ICa-L)、Ry R2及受磷蛋白(PLB)等多種Ca2＋運轉關鍵蛋白進行磷酸化修飾[15－16],一方面可引起ICa-L開放時間顯著延長,增加心肌細胞Ca2＋內流,另一方面還可引起Ry R2 舒張期異常開放,增加舒張期Ry R2的Ca2＋泄露,這些改變可最終導致心肌細胞內Ca2＋蓄積。而線粒體Ca2＋穩態是線粒體穩態的一個重要方面,在細胞生理和病理過程中發揮著一系列關鍵作用,包括能量代謝、細胞凋亡和活性氧(ROS)的產生[17]。Santulli等[18]發現Ca2＋通過Ry R2從內質網泄露導致線粒體內Ca2＋超載,在心力衰竭中起關鍵作用。線粒體Ca2＋超載會導致線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)的打開,允許小于1.5 k Da 的分子自由通過[19]。這會導致線粒體膜電位的破壞、膜通透性的改變、線粒體滲透腫脹、線粒體破裂、ATP 合成減少以及細胞色素C 從膜間釋放[19]。此外,mPTP 的開放和隨后線粒體的解偶聯還會導致胞漿ATP 的活性水解和胞漿中ATP 含量的減少。綜上所述,線粒體內Ca2＋超載可能是頻發性PVC造成線粒體異常的一個機制,但需要進一步研究證實,明確相關機制將為臨床PVC-ICM 患者的治療提供理論依據。