直接多重TaqMan qPCR方法快速鑒定褐飛虱屬3種飛虱

羅舉 楊素文 貝文勇 余軍偉 唐健 劉淑華,*

直接多重TaqMan qPCR方法快速鑒定褐飛虱屬3種飛虱

羅舉1楊素文2貝文勇3余軍偉4唐健1劉淑華1,*

(1中國水稻研究所，杭州 311401；2湖南省邵東市牛馬司鎮農業綜合服務中心，湖南 邵陽 422803；3廣西昭平縣植保植檢站，廣西 賀州 546800；4杭州優思達生物技術有限公司，杭州 310015;*通信聯系人, email: liushuhua@caas.cn)

【目的】褐飛虱（）是水稻重大害蟲，燈光誘捕一直是褐飛虱監測的重要方法。然而，褐飛虱的兩個同屬近似種偽褐飛虱（）和擬褐飛虱（）也具有撲燈行為，常被誤判為褐飛虱。針對測報燈下褐飛虱屬近似種形態鑒定費時費力、專業技能要求高，偽褐飛虱和擬褐飛虱常被誤判為褐飛虱這一問題，擬建立一種褐飛虱屬3種飛虱的快速分類鑒定方法?！痉椒ā恳詶l形碼基因為靶標，篩選褐飛虱屬通用引物及物種特異性探針，建立并優化直接多重Taqman qPCR檢測體系（Direct Multiplex TaqMan quantitative PCR, dmTqPCR），并分析其特異性、靈敏度及實用性?！窘Y果】本研究建立的3種飛虱dmTqPCR檢測方法特異性強，可準確區分褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱；靈敏度高，檢出限可達10拷貝/反應；大樣本檢測結果表明，382個樣本從樣本獲取到結果輸出的整個過程可在3 h內完成，檢出率及準確率均為100%?！窘Y論】本研究建立的褐飛虱屬近似種的dmTqPCR鑒定方法可以用于褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱的快速分類鑒定，有利于燈下褐飛虱的精準測報。

褐飛虱；偽褐飛虱；擬褐飛虱；ITS1；直接多重Taqman qPCR

褐飛虱[St?l]是我國及東南亞水稻重大害蟲，也是我國農業農村部公告（第333號）公布的一類農作物10種（類）蟲害之一。褐飛虱屬于半翅目（Hemiptera）飛虱科（Delphacidae）褐飛虱屬（Distant），全世界范圍共記錄褐飛虱屬18個種，我國所處的東洋區有8種，其中褐飛虱、偽褐飛虱[China]和擬褐飛虱[]是我國稻田燈下常見的三種同屬近似種[1-3]。偽褐飛虱和擬褐飛虱并不取食水稻，而是以禾本科的游草和秕谷草為最適宜寄主[4]。然而，3種飛虱具有廣泛的共同分布區域，發生季節也有交叉（4月―10月），且都具有撲燈習性。不同地點測報燈下，偽褐飛虱、擬褐飛虱的發生比例可分別高達46.8%和39.3%[5, 6]。褐飛虱、擬褐飛虱和偽褐飛虱形態、體色和外部特征均非常相似，肉眼難以區分，需專業人員借助顯微鏡才能鑒定[7]（圖1）。顯微鏡下先看體形和體色分出雌雄，再看顏面分出擬褐飛虱，最后看外生殖器區分出褐飛虱和偽褐飛虱[8]。人工進行鑒定耗時費力，對專業技能要求高。目前市場上基于RGB（red, green, blue）圖像識別原理的智能蟲情測報燈對偽褐飛虱、擬褐飛虱的鑒定更是無能為力，偽褐飛虱及擬褐飛虱均作為褐飛虱進行統計，嚴重影響了測報的準確性。因此，亟需研發快速鑒定手段，彌補形態學鑒定及圖像識別技術的局限，達到快速準確監測的目的。針對褐飛虱屬昆蟲，崔亞麗[9]曾利用核糖體間隔區基因（internal transcribed spacer, ITS）設計引物，初步建立了基于電泳的3種飛虱的多重PCR檢測技術(需PCR儀+電泳儀)，由于是以純基因組DNA為模板，具有耗時長、操作復雜等缺點。Liu等[10]在此基礎上，重新設計引物建立了3種飛虱的直接多重PCR檢測方法，該方法以加水研磨的蟲體粗組織液為模板，不需要提取DNA，將檢測時間大大縮短。羅舉等[11]建立了基于重組聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA)和側流層析試紙條（lateral flow dipstick, LFD）的褐飛虱快速鑒定技術，可在不借助任何儀器的情況下在12 min內完成檢測。這些技術雖都能準確鑒定物種，且對分類專業技能無要求，但都存在一定的不足。崔亞麗[9]與Liu等[10]的方法將PCR擴增與電泳檢測環節分開，時效性欠佳；羅舉等[11]的方法雖然檢測速度很快，但只能區分褐飛虱與非褐飛虱，不能檢測偽褐飛虱與擬褐飛虱。盡管已有多種褐飛虱屬昆蟲的分子鑒定方法，但在時效性及檢測通量上還都存在一定的不足。本研究以褐飛虱屬3種飛虱為對象，借鑒醫學領域的等位基因分型思路，設計褐飛虱屬通用引物及物種特異性探針，以加水研磨的蟲體粗組織液為檢測模板，建立一種快速、簡便的直接多重TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。升級現有的燈下飛虱速檢技術，解決燈下褐飛虱鑒定耗時、費力、專業技能要求高的難題，促進我國褐飛虱精準測報事業發展，為褐飛虱的精準綠色防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 昆蟲樣本準備

2021年度收集的廣西昭平、湖南邵東和浙江富陽的測報燈下褐飛虱、偽褐飛虱、擬褐飛虱、白背飛虱（）、稗飛虱（）、煙翅白背飛虱（）、灰飛虱（）、廖飛虱（）、短頭飛虱（）和黑邊梅塔飛虱（）的干蟲樣本，經形態鑒定后，單頭分裝保存于1.5 mL的離心管中。

1.2 主要儀器與試劑

熒光定量PCR儀（Quantstudio 3，美國賽默飛世爾科技有限公司）；研磨儀（LC-TG-48，上海力辰邦西儀器科技有限公司）；TaqMan通用PCR預混液（A30865，美國賽默飛世爾科技有限公司）；Taq酶試劑盒（KME-101，日本東洋紡生物科技有限公司）；T載體（CB501，北京擎科生物科技有限公司）；質粒小提試劑盒（32917KA1，Axygen）。

1.3 引物與探針的設計

參考Liu等[10]報道的核糖體DNA內轉錄間隔區1（internal transcribed spacer-1, ITS1）序列，在3種飛虱的保守序列部位設計屬內通用擴增引物ITS1-F/ITS1-R，褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱的目標片段長度分別為132 bp（base pair）、159 bp和160 bp；在差異序列部位設計物種特異性Taqman MGB探針Nl-ITS1-P、Nm-ITS1-P和Nb-ITS1-P，并分別標記FAM、VIC和ROX熒光素。不同物種的差異堿基序列最好位于探針的中間1/3處，有利于提高探針的特異性。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物探針序列及位置見表1和圖1。

1.4 dmTqPCR的特異性分析

以單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)分型原理進行昆蟲近似種鑒定，通用引物要確保在所檢測的多種目標昆蟲中都能有效擴增，特異性探針則只能與靶標昆蟲的擴增片段進行結合。以褐飛虱、偽褐飛虱、擬褐飛虱、白背飛虱、稗飛虱、煙翅白背飛虱、灰飛虱、廖飛虱、短頭飛虱和黑邊梅塔飛虱的粗組織液為模板，首先以普通PCR及凝膠電泳檢測法進行擴增引物ITS1-F/R的特異性驗證，再次參照說明書進行dmTqPCR檢測，分析多重檢測體系的特異性。多重反應體系包括2×Taq PathTMproAmpTMMaster 5 μL，ITS1-F/R（10 μmol/L）各0.2 μL，10 μmol /L的Nl-P、Nm-P和Nb-P探針各0.2 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 2.0 μL。反應條件如下：95℃預變性，5 min；95℃變性10 s，60℃20 s，共40個循環。

1.5 dmTqPCR的靈敏度分析

以褐飛虱、偽褐飛虱、擬褐飛虱的基因組DNA作為模板，應用引物對ITS1-F/R進行PCR擴增，凝膠回收PCR產物，連接T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性菌落，抽提質粒并進行測序鑒定。鑒定正確的重組質粒作為陽性標準品，分別命名為Nl-ITS1、Nm-ITS1和Nb-ITS1。將3種重組質粒標準品Nl-ITS1、Nm-ITS1、Nb-ITS1混合后10倍等比稀釋，取終濃度為1×100～1×107拷貝/μL的質?；旌衔镒鳛槟０?，按上述多重Taqman qPCR體系進行靈敏度檢測。質粒標準拷貝數計算公式為：

DNA拷貝數（copies/μL）=質粒濃度（ng/μL）×6.02×105/660×質粒堿基數（bp）。

1.6 dmTqPCR的實用性評價

使用所建立的多重Taqman qPCR檢測體系對2021年度在廣西昭平、湖南邵東和浙江富陽地區采集的382個飛虱樣本粗組織液進行測試（單頭飛虱用500 μL H2O研磨）（表2），以3種飛虱質粒的混合液為陽性對照（1×105拷貝/μL），無菌水為陰性對照。測試結果與專家形態學鑒定結果比較，驗證方法的準確性。另外，準確計算了從樣本獲得到結果輸出的總時長，評價其適用性。

Nl―褐飛虱；Nm―偽褐飛虱；Nb―擬褐飛虱。下劃線序列代表引物位置，藍色背景為探針位置。

Fig. 1. Multiple alignment of ITS1 genes fromand its two sibling species.

表2 樣本收集地點

1―水；2～3―褐飛虱；4～5―偽褐飛虱；6～7―擬褐飛虱；8―白背飛虱；9―灰飛虱；10―煙翅白背飛虱；11―稗飛虱；12―廖飛虱；13―短頭飛虱；14―黑邊梅塔飛虱；M―100 bp DNA標準品

Fig. 2. Specificity analysis of the inter-speies general primes ITS1-F/R.

Nl―褐飛虱；Nm―偽褐飛虱；Nb―擬褐飛虱。

Fig. 3. Specificity analysis of the direct multiplex TaqMan qPCR assay.

2 結果與分析

2.1 dmTqPCR檢測特異性

引物特異性分析結果表明，ITS1-F/R引物在褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱中都能擴增出單一明亮條帶（100～200 bp），而白背飛虱、灰飛虱、煙翅白背飛虱、稗飛虱、廖飛虱、短頭飛虱和黑邊梅塔飛虱均無明顯擴增條帶（圖2）。直接參照說明書的體系與條件進行多重檢測，結果表明褐飛虱探針Nl-P和偽褐飛虱探針Nm-P都很特異，在非目標飛虱中均無任何擴增；而擬褐飛虱探針Nb-P特異性稍差，在褐飛虱和偽褐飛虱中都有輕微擴增，但并不影響結果（圖3）。多組分圖顯示（圖3），只有褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱顯示出良好的“S”形擴增曲線，而非靶標飛虱和空白對照均無明顯擴增，說明所建立的dmTqPCR體系可以用于3種飛虱的定性鑒定。

2.2 dmTqPCR檢測靈敏性

利用所建立的dmTqPCR體系對不同濃度的3種飛虱的重組質?；旌弦哼M行測定，結果表明該體系對褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱的檢出限（Limit of detection, LOD）均為10拷貝（圖4）。由建立的標準曲線可知，該多重體系對褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱基因的擴增效率分別為97.61%，96.20%和97.13%，決定系數2分別為0.998、0.999和0.998，建立方程=?3.381+38.310、=?3.417+37.40和=?3.393+38.343（其中代表值，代表拷貝數對數值）。

2.3 dmTqPCR檢測實用性

為評估所建立的dmTqPCR檢測體系的實際應用效果，對2021年度3個不同省份站點收集的共382頭飛虱盲樣進行檢測，以3種飛虱質粒的混合液為陽性對照（1×105拷貝/μL），無菌水為陰性對照。結果表明，褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱樣本分別為189頭、121頭和72頭，與人工鑒定結果完全一致，檢出率與準確率均為100%（部分結果如表3）。本研究中，利用高通量組織研磨儀制備樣本粗組織液5～10 min，試劑配制及加樣約50 min，上機檢測約40 min，382個樣本從樣本獲取到結果輸出的整個過程可在3 h內完成。

1～8分別代表1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100拷貝/μL。

Fig. 4. Sensitivity analysis of the direct multiplex TaqMan qPCR assay.

表3 直接多重TaqMan qPCR檢測體系對382個樣本檢測的部分結果

Nl―褐飛虱；Nm―偽褐飛虱；Nb―擬褐飛虱；Pc―陽性對照；Nc―陰性對照。

Nl,; Nm,; Nb,; Pc, Positive control; Nc, Negative control.

3 討論

褐飛虱是水稻重大害蟲，測報燈下褐飛虱的數量動態是目前褐飛虱蟲情測報的關鍵依據之一[12]。然而，市場上的所有誘蟲燈都不具有誘蟲特異性，誘捕靶標害蟲的同時也會誘捕大量非靶標昆蟲。自羅舉等[5]報道我國燈下存在高比例的偽褐飛虱和擬褐飛虱以來，褐飛虱及其近似種的正確區分及快速鑒定引起了人們的高度重視。崔亞麗[9]及Liu等[10]建立的基于多重PCR和直接多重PCR的褐飛虱及其近似種鑒定方法都依賴于變溫PCR儀和電泳儀等精密儀器，不利于在基層植保站推廣應用。羅舉等[11]建立的基于恒溫PCR的褐飛虱快速鑒定方法，雖擺脫了對精密儀器的依賴，但并不能鑒定偽褐飛虱和擬褐飛虱。因此，本研究建立了基于Taqman qPCR的褐飛虱屬3種飛虱的多重快速檢測方法，可同步快速準確區分褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱。該方法靈敏度高，對3種飛虱的最低檢測線均可達到10拷貝/反應；具有較好的抗干擾性，可直接以粗組織液為模板，節約了DNA提取時間與試劑成本；檢測迅速，382個樣本的檢測可在3 h內完成；大樣本檢測結果表明，該方法對3種飛虱的檢出率及準確率均為100%；該方法由于實現了DNA擴增與DNA檢測的同步進行，較Liu等[10]的直接多重PCR檢測方法大大提高了檢測效率，實用性更強。

核酸檢測技術因快速、準確、操作簡便，廣泛用于近似昆蟲的分類鑒定，也常用于檢疫性及農業害蟲的快速檢測。例如，黃麗莉等[13]利用線粒體細胞色素C氧化酶Ⅰ（cytochrome coxidase Ⅰ, COⅠ）基因作為分子標記實現了對茶園5種薊馬的分類鑒定；張磊等[14]利用變溫PCR擴增與測序技術建立了草地貪夜蛾（）的分子鑒定方法；吳霞等[15]和李茵等[16]利用TaqMan qPCR技術建立了茶黃薊馬（）與西花薊馬（）的快速檢測方法。核酸檢測技術主要包括樣本核酸制備、擴增和檢測三個模塊，若要實現快速準確檢測，達到易推廣的要求，需對這三個模塊分別進行優化。樣本核酸制備是核酸檢測的第一步，傳統的昆蟲核酸檢測技術多是以純DNA為模板，而本方法是以粗組織液為模板，節省了DNA提取時間，時效性更強。核酸擴增是核酸檢測的主體環節，在變溫PCR擴增技術成熟發展的基礎上，恒溫PCR擴增也逐步應用于昆蟲的快速分類鑒定，如RPA技術[17]和環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）[18-22]。LAMP方法一般需要4～6條引物，不適用于多重檢測體系的構建；RPA方法雖然只需要2條引物，但引物一般要求30～35 bp，較長引物容易形成二級結構，多重體系構建難度大。因此，本文仍然選擇了變溫PCR擴增技術進行DNA擴增，這有利于褐飛虱屬3種飛虱多重快速檢測體系的構建。對于核酸檢測模塊，一般可分為終點法和實時法，常用的終點法有Sanger測序和凝膠電泳，實時法即熒光定量法。熒光定量法因將核酸擴增及核酸檢測環節同步進行，因此在時效性方面更佳。Taqman探針法也是實時熒光定量方法的一種，可以實現單核苷酸的差異檢測，也常用于昆蟲近似種的分類鑒定。徐浪等[23]建立了新菠蘿灰粉蚧（）和菠蘿灰粉蚧（）的雙重檢測技術，Aguirre等[24]建立了白緣象甲（）和南美果樹象甲（）的雙重檢測技術。綜合考慮，本研究選擇了Taqman qPCR技術進行褐飛虱屬3種飛虱的多種檢測體系構建。構建單管多重檢測體系最重要是要關注引物/探針的互作效應，有些單重檢測驗證良好的引物/探針并不能直接用作多重檢測。本研究中巧妙的利用了SNP分型原理，選用一對通用引物和三條物種特異性引物進行多重體系構建，因只涉及5條短核苷酸序列，且三個探針的序列大部分相同，所以多重檢測體系相對容易構建。建立多重Taqman定量體系，MGB探針最好不要超過2個，由于本研究只是進行定性檢測，雖然3條探針均是以MGB作為淬滅集團，但仍能正確區分3種飛虱。從表3可知，不同種類昆蟲及同種昆蟲間值差異較大，這是由于所選用的ITS1是核糖體多拷貝基因導致的，如進行定量檢測體系的構建，最好是選擇細胞核單拷貝基因。

目前，昆蟲學領域的單管多重核酸檢測技術最多可達到3重，應用潛力仍然受限。廈門大學的李慶閣團隊報道了一種“MeltArray”的熒光PCR新技術，可以實現單個熒光通道檢測12個靶標，常規熒光定量PCR儀的4個通道可以檢測多達48個靶標[25]。MeltArray技術為昆蟲的快速分類鑒定展現了很好的發展愿景，理論上可以實現對任何近似昆蟲種類的快速檢測。目前，用于昆蟲鑒定的多重檢測技術，多是基于多對引物建立的體系[23]，而本研究是借鑒了SNP分型原理，利用一對褐飛虱屬通用擴增引物和三個物種特異性探針鑒定，這成功規避了單管中多條引物的抑制互作效應，相同思路的方法在其他昆蟲中也有所報道[26]。需要注意的是，雖然多種分子檢測技術可用于昆蟲的快速分類鑒定，然而都是單頭定性鑒定技術，當面對大量樣本時，需要逐一分揀檢測，效率低且成本高。因此，怎樣將核酸檢測技術從單頭定性鑒定升級為多頭定量檢測，將是未來重點的發展方向，也是解決誘蟲燈下三種近似種快速精準監測的主要出路。

綜上所述，本研究建立了褐飛虱屬3種飛虱的直接多重Taqman qPCR檢測方法，實現了褐飛虱、偽褐飛虱和擬褐飛虱的快速準確鑒定，可為褐飛虱的精準綠色防控提供技術支撐。不足之處是，本技術仍需精密儀器介入，不利于現場即時檢測及在基層大范圍推廣。未來有必要研發基于恒溫PCR的3種飛虱直接多重檢測技術及基于“昆蟲湯”的褐飛虱屬3種飛虱的精準定量技術。

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Direct Multiplex TaqMan qPCR Assay for Rapid Detection of Three Sibling Species fromDistant

LUO Ju1, YANG Suwen2, BEI Wenyong3, YU Junwei4, TANG Jian1, LIU Shuhua1,*

(1China National Rice Research Institute, Hangzhou 311401, China;2Agricultural Comprehensive Service Center, Niumashi Town, Shaodong City, Hunan Province, Shaoyang 422803, China;3Plant Protection and Inspection Station of Zhaoping County, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Hezhou 546800, China;4Hangzhou Ustar Biotechnology Co., Ltd., Hangzhou 310015, China;*Corresponding author, email: liushuhua@caas.cn)

【Objective】is a destructive insect pest on rice, and light trapping has always been an important monitoring method. However, its two sibling species,and, can also be trapped by light and are easily mistaken as. Morphological identification ofand its sibling species is time-consuming and labor-intensive, with the requirement for expertise and experience. To address this problem for identification ofand its two sibling species, the present study is aimed to develop a rapid and accurate identification method.【Method】At first, design and select the interspecies general primes and species-specific probes based on the barcoding gene. Then, establish and optimize the Direct Multiple Taqman qPCR assay (dmTqPCR). Finally, analyze and evaluate the specificity, sensitivity and practicability.【Results】The dmTqPCR assay developed in the present study has high specificity and high sensitivity, which could accurately identify,andandthe LOD (limit of detection) are up to 10 copies/reaction.The entire detection process for 382 specimens, including the crude tissue liquid preparation, amplification and detection, can be completed in 180 min with an accuracy of 100%.【Conclusion】The established dmTqPCR assay is suitable for rapid and accurate identification of,and,and it is expected to promote the development of precision prediction and forecasting of.

;;; ITS1; direct multiple Taqman qPCR

10.16819/j.1001-7216.2023.220903

2022-09-06;

2022-11-12。

浙江省自然科學基金資助項目（LGN21C140002）；十四五重點研發計劃資助項目（2021YFD1401100）；水稻生物學國家重點實驗室開放課題（20210303）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（CPSIBRF-CNRRI-202123）。