哈茨木霉配施高碳基肥對植煙土壤理化性質和細菌群落結構的影響

任志超 穆耀輝 匡志豪 李淑娥 張永峰 任天寶 殷全玉 劉國順

摘要：探究哈茨木霉配施高碳基肥對根際土壤細菌群落結構及理化性質的影響，為調控煙草微環境及改善土壤提供理論依據。采用大田試驗方法，設置4個處理：T1（哈茨木霉菌劑750 kg/hm2+常規施肥）、T2（高碳基肥 750 kg/hm2+常規施肥）、T3（哈茨木霉菌劑750 kg/hm2+高碳基肥750 kg/hm2+常規施肥）和CK（常規施肥），通過高通量測序技術探究哈茨木霉配施高碳基肥對根際土的細菌群落結構和土壤理化性質的影響。結果表明：（1）不同施肥處理改善根際土壤理化性質的效果總體表現為T3處理＞T1處理＞T2處理，T3處理顯著提高了土壤的pH值、全氮含量、全碳含量、硝態氮含量、銨態氮含量、速效磷含量和速效鉀含量（P<0.05），增幅分別為7.63%、41.67%、20.80%、63.70%、28.98%、15.07%和9.51%；（2）烤煙根際土細菌群落結構α多樣性指數在哈茨木霉菌劑和高碳基肥間存在顯著互作效應，哈茨木霉菌劑處理的根際土細菌多樣性指數相對較低，而CK較高且與T2處理和T3處理差異不顯著；（3）LefSe分析結果表明，不同施肥處理的根際土關鍵微生物類群存在明顯差異，且對不同施肥處理的響應也存在差異；（4）β多樣性分析結果表明，3個施肥處理的根際土細菌群落結構與對照組土壤呈現明顯的分離效應，高碳基肥處理的響應模式與T3處理相似，但響應程度不及后者。說明哈茨木霉菌劑和高碳基肥間存在顯著互作效應。在生產中，可利用哈茨木霉配施高碳基肥改良土壤和煙草微生態環境。

關鍵詞：哈茨木霉；高碳基肥料；植煙土壤；理化性質；細菌群落結構

中圖分類號：S572.06 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0223-09

基金項目：中國煙草總公司陜西省公司科技項目（編號：2021611000270042）。

作者簡介：任志超（1998—），男，黑龍江綏化人，碩士研究生，主要從事煙草栽培與生理研究。E-mail：1132007123@qq.com。

通信作者：殷全玉，博士，副教授，主要從事煙草資源微生物利用與土壤保育研究。E-mail：quanyuy@126.com。

土壤作為自然界最為復雜的生態系統之一，是影響植物生長發育的關鍵因素［1］。大量的微生物存在于土壤之中，它們在土壤中的分布特征和組成多樣性不僅反映了土壤質量的好壞，還具有維持能量流動、物質循環、信息交換、土壤修復及各種土傳病害的防治等功能［2-5］。有研究證明，生物炭是一種很有應用前景的土壤改良劑，可以有效改良土壤的微環境［6-7］。生物炭是各種固體農林廢棄物在厭氧條件下熱解碳化產生的高度芳香化的富碳有機產物［8-10］。相關研究表明，生物炭可以用來抑制病原菌的繁殖，改善土壤理化性質，促進作物生長及調節土壤微生態環境［11-13］。Shen等對患病烤煙施加生物炭后發現，生物炭的施用可有效提高土壤中細菌的群落結構及多樣性，并降低致病細菌的豐度，從而有效降低烤煙的發病率［14］。Rose等的研究表明，在甘蔗中添加生物炭可提高土壤的pH值和水分含量，同時還會降低甘蔗紅腐病的發病率［15］。而高碳基肥作為以生物炭為核心原料的新型有機肥料，同時也具有改善土壤理化性質、調節土壤微生態環境等積極作用［16-17］。蘇夢迪等在植煙土壤中施加高碳基肥有效改善了土壤的理化性質和植煙土壤的微生物群落結構和多樣性［18］。李怡博等研究發現，高碳基肥與微生物肥料配施可提高植煙土壤中微生物的數量和土壤pH值、堿解氮含量、速效磷含量、速效鉀含量等理化指標［19］。

木霉是自然界中的一類有益生防菌，據統計，木霉對18個屬30種植物病原菌具有良好的生防效果，并且具有分布廣、適應性強、繁殖快等特點［20-21］。它不僅可以改善土壤的理化性質，同時對作物根際土微生物的群落結構及多樣性具有積極影響［22-23］。Fu等在種植玉米時施加木霉菌劑發現，經木霉菌劑處理后玉米根際土壤的養分含量、酶活性和生長特性有明顯的改善，從而優化了根際土壤的細菌群落結構及多樣性［24］。Pang等研究發現，在番茄土壤中施加富含木霉的有機肥可以抑制番茄土壤微生物群落退化從而維持番茄的健康發育［25］。目前，木霉菌劑和高碳基肥在植煙土壤保育和微生態環境領域的研究廣泛［26-28］，而對于有關兩者配施的研究鮮有報道。鑒于此，本試驗通過高通量測序的方法對哈茨木霉配施高碳基肥的植煙土壤理化性質和細菌群落結構進行分析，探究哈茨木霉配施高碳基肥對植煙土壤理化性質和細菌多樣性的影響，以期為哈茨木霉配施高碳基肥在煙草生產上的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

于2020年 2—10月在陜西省商洛市洛南縣（108°34′20″～111°1′25″E，33°2′30″～34°24′40″N之間）設置田間試驗。試驗區屬暖溫帶季風性濕潤氣候，海拔在800～1 200 m之間，年平均氣溫 11.5 ℃，年平均降水量為700～850 mm，年均日照時數 2 045 h。土壤質地為黏壤土，試驗開始前耕層（0～20 cm）土壤的基本理化性質：有機質含量 11.21 g/kg、pH值5.45、全氮含量0.10%、全碳含量1.13%、速效鉀含量147.42 mg/kg、速效磷含量21.52 mg/kg。

供試煙草品種為云煙99，由商洛市洛南縣煙草公司統一漂浮育苗，于3月15日播種，5月1日移栽；供試哈茨木霉Z-19菌劑由筆者所在實驗室提供和保存，有效活菌數為10×109 CFU/mL；供試高碳基肥由河南惠農土質保育研發有限公司提供，其有效成分含量分別為總碳含量27.09%、總氮含量1.74%、磷含量1.28%、鉀含量0.86%、含水率26.36%、pH值8.19；蚯蚓糞由當地煙草公司提供。

試驗處理分別為CK［常規施肥：煙草專用肥（N、P2O5、K2O含量分別為12%、10%、23%） 750 kg/hm2+蚯蚓糞1 t/hm2+西洋復合肥（N、P2O5、K2O含量分別為16%、6%、23%）150 kg/hm2］、T1處理（哈茨木霉菌劑750 kg/hm2+常規施肥）、T2處理（高碳基肥750 kg/hm2+常規施肥）和T3處理（哈茨木霉菌劑750 kg/hm2+高碳基肥 750 kg/hm2+常規施肥）。試驗采用隨機區組排列方法，5次重復，設保護行。行距為1.2 m，株距為0.5 m，小區面積為66.7 m2。高碳基土壤修復肥全部用作基肥條施，哈茨木霉菌劑與移栽水混勻后灌根即可，其他田間管理措施按照當地生產技術規范進行。

1.2 樣本采集

在煙草移栽75 d時，避開雨天和過度干旱期。取樣方法參照文獻［29］，按照五點取樣法在每個處理選取20個取樣點，即每個處理重復5個取樣點，利用鏟子將煙株周圍10 cm的土壤挖至30 cm深，挖出煙株的整個根部放于盆中，搖動根部并用鏟子從根部去除土壤置于盆中，采集2份盆中的土壤，一部分除去各種雜質后混勻過2 mm篩并取5 g于 10 mL 無菌離心管中直接用干冰運送到上海美吉生物醫藥科技有限公司進行土壤細菌多樣性檢測，剩余部分土壤置于密封袋內快速運回實驗室，-80 ℃保存并進行理化性質分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質分析

測定方法參照文獻［30］，土壤全氮、全碳含量用全自動碳氮分析儀（vario MAX CN，德國）測定；硝態氮和銨態氮含量用全自動化學分析儀（Smartchem140）測定；土壤pH值用電位法測定；速效磷含量采用 0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用1 mol/L乙酸銨浸提-火焰光度計法測定。

1.3.2 土壤DNA提取和聚合酶鏈式反應（PCR）擴增方法

使用土壤基因組DNA快速抽提試劑盒提取土壤微生物群落DNA，并利用上海美吉生物醫藥科技有限公司進行高通量測序。測序流程分為PCR擴增、PCR產物的混樣與純化、文庫的構建3個部分。對細菌V3～V4可變區進行PCR擴增，其引物為338F（5′-[JP9]ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-[JP9]GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。擴增程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環；之后72 ℃穩定延伸10 min，最后在4 ℃保存。

1.3.3 Illumina Miseq 測序

將同一樣本PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）純化回收產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTM Fluorometer （Promega，USA） 對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：（1）接頭鏈接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。原始數據上傳至NCBI SRA數據庫。

1.4 數據分析

采用Excel 2019和 DPS 7.0 軟件分析處理數據，用R語言工具制圖。

2 結果與分析

2.1 不同施肥處理對根際土壤理化性質的影響

對不同施肥處理的根際土壤中的pH值、全氮含量、全碳含量、硝態氮含量、銨態氮含量、速效磷含量和速效鉀等含量指標進行測定。從表1可以看出，不同施肥處理后植煙土壤的理化性質表現為T3處理＞T1和T2處理＞CK，T1處理顯著提高了根際土壤的硝態氮、速效磷、速效鉀的含量（P<0.05），增幅分別為50.23%、12.18%、7.31%；T2處理顯著提高了pH值及全氮、速效磷、速效鉀的含量，增幅分別為4.01%、25.00%、6.69%、5.12%；T3處理顯著提高了pH值及全氮、全碳、硝態氮、銨態氮、速效磷、速效鉀的含量，增幅分別為7.63%、41.67%、20.80%、63.70%、28.98%、15.07%、9.51%。不同施肥處理的其他指標雖未達到顯著水平，但均有不同程度增加。不同施肥處理改善根際土壤理化性質的效果總體表現為T3處理＞T1處理＞T2處理?？梢?，哈茨木霉菌劑和高碳基肥料均能不同程度地改善根際土壤理化性質，而哈茨木霉菌劑配施高碳基肥會顯著優化高碳基肥料對土壤的改良效果。

2.2 樣品脫機測序數據統計

表2為高通量測序后各處理土壤樣本脫機數據的統計結果，按照97%的相似性閾值聚類后，該試驗土壤樣本的平均有效序列數為47 393條，平均序列長度為414 bp，平均最短序列長度為245 bp，平均最長序列長度為479 bp。說明該試驗通過高通量測序獲取了足夠的有效數據量，可以進行后續分析。

2.3 α多樣性分析

2.3.1 樣本OTU測序分析

圖1為各處理土壤樣本的Pan曲線（左）與Core曲線（右），隨著測序樣本量的增大，Pan曲線斜率逐漸升高，各處理樣本包含的OTU總和不斷增加并趨于平緩，表明該試驗土壤樣本的測序評估質量達到了后續分析要求。其中，CK組總OTU數最高，T1組的總OTU數最低，T2組和T3組的總OTU數在CK組和T1組之間。Core曲線反映了所有樣本的核心OTU數變化情況，這里觀察到Core曲線的斜率逐漸下降，各個樣本間共有的OTU數量逐漸減少并達到平穩，物種測序評估質量達到了后續分析要求。

2.3.2 α多樣性指數分析

依據最小樣本序列數進行抽平，用于分析各樣本的有效序列數量為 28 693 條，各處理土壤樣本經過97%的相似性閾值劃分及OTU聚類后可歸類為36門、102綱、237目、378科、748屬、1 415種以及3 187個OTU。

α多樣性指數分析是通過一些統計學指數來分析并評估細菌群落結構的豐度與多樣性。從表3可以看出，不同施肥處理的序列觀測值表現為CK＞T2處理＞T3處理＞T1處理，Shannon指數和Chao1指數表現為CK＞T3處理＞T2處理＞T1處理，Simpson指數中哈茨木霉菌劑處理顯著高于其余處理?？梢钥闯?，不同施肥處理均不同程度地降低了植煙土壤細菌群落結構的豐度和均勻性，且哈茨木霉菌劑處理的α多樣性指數顯著低于其化各處理（Simpson指數除外），其余處理雖不存在顯著差異，但是數值上還是出現了差距，T2處理和T3處理的α多樣性指數均有不同程度的降低，說明不同肥料的施用影響了土壤的細菌群落結構多樣性。

2.4 細菌群落組成與結構分析

2.4.1 門水平細菌群落分布

圖2為各處理細菌在門水平上的相對豐度，可以看出，各處理土壤樣本與常規施肥的土壤根際細菌群落結構在門水平上基本一致，但相對豐度含量存在差異，供試土壤樣本的主要優勢細菌為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteriota），主要優勢細菌的豐度之和占細菌總豐度的80%以上。相比于常規施肥處理，放線菌門在施用哈茨木霉菌劑后的相對豐度提高了9.37百分點，在施用高碳基肥料后的相對豐度降低了3.19百分點，在T3處理后的相對豐度降低了5.43百分點；變形菌門在3個處理中的相對豐度分別表現為降低0.31百分點、增加3.85百分點、增加6.19百分點；綠彎菌門在3個處理中的相對豐度分別降低2.28、1.25、1.07百分點；酸桿菌門在3個處理中的相對豐度分別降低了3.16、1.06、3.15百分點。

圖3為各處理在門水平上存在極顯著或顯著性差異的細菌，相比于常規施肥處理，T1處理的土壤根際細菌群落結構中放線菌門的相對豐度顯著升高，酸桿菌門和芽單胞菌門（Gemmatimonadota）的相對豐度顯著降低；T2處理的土壤根際細菌群落結構中，放線菌門和芽單胞菌門的相對豐度顯著降低，而變形菌門、擬桿菌門（Bacteroidota）和髕骨細菌門 （Patescibacteria）的相對豐度顯著升高；T3處理的土壤根際細菌群落結構中，放線菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門的相對豐度顯著降低，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門的相對豐度顯著升高。由此可知，不同的施肥處理均改變了根際土的細菌群落結構，且施肥不同根際土的細菌群落結構改變程度也有所不同，同時，T3處理可顯著提高高碳基肥對土壤根際細菌群落結構的優化效果。

2.4.2 屬水平細菌群落分布

圖4為各處理細菌屬水平上的相對豐度，總共檢測到18個屬，其相對豐度在不同施肥處理間存在差異。施用不同肥料后，18個屬的總豐度在T2處理組中表現為降低，在T1處理組和T3處理組中表現為增加。與常規施肥處理相比，T1處理組的18個屬中，有9個屬的占比表現為升高，9個屬表現為下降；在T2處理組中，有7個屬的占比表現為升高，11個屬表現為下降；在T3處理組中，有9個屬的占比表現為升高，9個屬表現為下降。同時，不同施肥處理所改變的細菌種類也并不完全相同。表明不同的施肥處理均改變了根際土屬水平上的細菌群落結構，且施肥不同，根際土的細菌群落結構改變程度也有所不同。

2.4.3 不同施肥處理對烤煙根際土關鍵微生物的影響

鑒于土壤中微生物的數量之多，豐度差別之大，因此有必要明確不同施肥處理對烤煙根際土壤微生物的影響。以線性判別分析（LDA）值≥4為標準進行LefSe分析，以明確不同施肥處理的差異微生物以及它們在不同分組中的富集情況。圖5是不同施肥處理烤煙根際土壤中關鍵微生物的多級物種層次樹圖，其中在常規施肥土壤中高度富集的微生物包括酸桿菌門和嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）；在施用哈茨木霉菌劑后，根際土壤中高度富集的微生物包括放線菌綱（Actinobacteria）、微球菌目（Micrococcales）和節桿菌屬（Arthrobacter）等；施入高碳基肥料處理后伯克氏菌目 （Burkholderiales）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）顯著富集；在T3處理后，根際土壤中高度富集的微生物包括羅丹諾桿菌科（Rhodanobacteraceae）、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、變形菌門和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）等，說明不同施肥處理根際土壤關鍵微生物的種群類別不同，以上微生物對土壤生物功能調節起到重要作用。

2.5 細菌群落組成的層級聚類及主坐標分析（PCoA）

2.5.1 細菌物種豐度聚類圖分析

根據物種注釋信息和豐度信息，在門水平上選取排名前35位的物種繪制熱圖（圖6）?？梢钥闯?，不同施肥處理間的細菌群落結構相似性不存在明顯差異。同時，不同處理之間的主要細菌門類相對豐度差別也不大。具體處理間層次聚類結果表明，T1處理與其余處理相距較遠，T2處理和CK距離最近，CK、T2、T3處理相對距離較近，聚成一組。

圖7是屬水平上前35位物種組成的層次聚類熱圖分析結果，不同施肥處理呈現出和門水平物種相同的分離效應。不同處理間主要優勢屬的相對豐度沒有得到很好的區分，說明通過層次聚類分析的方法可以體現出主要優勢物種的豐度分布，但是不同處理間彼此的豐度差異沒有很好地表現出來。

2.5.2 樣本群落比較分析

基于門水平對不同施肥處理的根際土壤細菌群落進行主坐標分析（圖8），組間差異達到顯著水平（P=0.001），主成分1（PC1）和主成分2（PC2）是降維提取出的對細菌群落結構作用最大的前2個主成分，貢獻率分別達到46.44%和28.29%。同CK的土壤樣本點相比，其余3個施肥處理的樣本點與其呈現不同程度的分離，T1、T2處理與CK的根際土細菌群落結構具有一定的相似性，T3處理的根際土細菌群落結構與常規施肥處理發生明顯的分離效應。對于T1處理，土壤樣本的分布態勢向PC1軸右上方向分布；根際土壤細菌群落結構對于T3處理和T2處理的響應模式是不同的，土壤樣本點沿著PC1軸左上移動分布，且T3處理的分布態勢更加明顯。這些結果表明，不同肥料的施用均不同程度改變了土壤細菌的群落結構，同時哈茨木霉菌劑配施高碳基肥優化了高碳基肥對根際土細菌群落結構的改善效果。

3 討論與結論

本研究發現，施加哈茨木霉菌劑和高碳基肥均可不同程度改善植煙土壤的理化性質，還會顯著提高高碳基肥料的效果。木霉菌可在土壤中傳播和作物根系中定殖，能夠有效改善土壤理化性質［23］。有研究報道，木霉菌會與土壤中的微生物互作，從而導致土壤中的氮、磷、鉀得以釋放和穩固［31］。高碳基肥為堿性肥料，其中有機質和生物炭占比較大，富含作物生長發育所需的各種營養成分，同時生物炭的多孔結構可吸附土壤中的營養成分，使其養分固持能力得到增強［18，32］。高碳基肥料中的生物炭可為土壤中的木霉菌提供繁殖發育的棲息地，同時木霉菌在土壤中促進某些微生物大量增殖后反過來作用于高碳基肥料，使土壤中的高碳基肥料得到充分吸收，促進了土壤中的信息交換和養分循環。所以，T3處理的效果最優，明顯高于其余處理水平。

不同施肥處理的根際土細菌群落結構α多樣性的變化趨勢不同。統計分析結果顯示，T1處理組的根際土細菌多樣性相對較低，其余處理均高于T1處理組且存在顯著差異，說明根際微生物的多樣性受到哈茨木霉菌劑的影響，這是因為哈茨木霉促進某些細菌的生長發育，導致細菌群落個體大小或數量差異增大，群落均勻度降低，進而導致多樣性指數減?。?3］。T2處理組與CK雖無顯著性差異，但還是稍有降低，這與范聲濃等的研究結果［34］相似，說明高碳基肥料的施入對烤煙根際土細菌多樣性指數無顯著影響。哈茨木霉菌劑配施高碳基肥后與對照組仍無顯著性差異，這就說明根際細菌群落結構α多樣性指數在高碳基肥和哈茨木霉菌劑間存在互作效應。

煙草根際土中，門水平上相對豐度發生明顯改變的細菌在不同施肥處理間表現不同。煙草根際土門水平的優勢細菌依次為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門，它們的豐度占細菌總豐度的80%以上，這與楊煥煥等在煙草中的研究結果［35］一致。施用哈茨木霉菌劑后放線菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門的相對豐度發生顯著或極顯著的改變；施用高碳基肥料和哈茨木霉菌劑配施高碳基肥后放線菌門、酸桿菌門、變形菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門和厚壁菌門的相對豐度發生顯著或極顯著的改變，而且哈茨木霉菌劑配施高碳基肥的改變效果高于單獨施用高碳基肥料。通過LefSe分析計算可知，不同施肥處理根際土壤關鍵微生物的種群類別不同，且對不同施肥處理的響應也存在差異，這和以往的研究結果［36］有相似之處。生物炭影響細菌菌群相對豐度變化的原因復雜且各不相同，還需更進一步研究。

由β多樣性分析結果可知，不同施肥處理的根際細菌群落結構間存在明顯差異，與對照組的土壤樣本相比，3個施肥處理的根際細菌群落結構呈現明顯的分離，且T3處理的根際土細菌群落結構呈完全分離效應，T2處理的響應模式與T3處理相似，但響應程度不及T3處理。說明哈茨木霉菌劑與高碳基肥可發生互作，哈茨木霉菌劑配施高碳基肥可優化提高高碳基肥對根際土細菌群落結構的改善效果。

綜上可知，哈茨木霉菌劑配施高碳基肥可顯著改良烤煙土壤的理化性質。根際土細菌群落結構α多樣性指數在哈茨木霉菌劑和高碳基肥間存在互作效應。同時，不同施肥處理根際土壤關鍵微生物的種群類別不同且對不同施肥處理的響應也存在差異。哈茨木霉菌劑和高碳基肥的根際土細菌群落結構明顯不同，其二者之間的響應模式也不同，哈茨木霉菌劑與高碳基肥可發生互作，且互作效果更佳。

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