強筋小麥貯藏蛋白的積累動態、種類及相對含量分析

房春豪 韓冉 毛鳳鑫 汪曉璐 徐文競 王開 祁廣 曹新有 李豪圣 劉愛峰 劉成

關鍵詞：強筋小麥；中筋小麥；麥谷蛋白；醇溶蛋白；谷蛋白大聚合體（GMP）

小麥籽粒主要由淀粉、脂類和蛋白質等物質組成。根據蛋白質組分在不同溶劑中的溶解性，將小麥籽粒蛋白分為溶于水的清蛋白、溶于稀鹽的球蛋白、溶于70%乙醇的醇溶蛋白和溶于稀酸或稀堿的麥谷蛋白。麥谷蛋白是一種非均質的大分子聚合體，是由多個亞基通過分子間二硫鍵相互交聯形成的多聚體，按其在SDS-PAGE中的遷移率，又分為高分子量麥谷蛋白（HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白（LMW-GS）。谷蛋白聚合體主要由HMW-GS和LMW-GS通過鏈間二硫鍵鏈接而成，其在非解離狀態下，由一系列分子量大小不同的聚合體組成。谷蛋白聚合體中，不溶于SDS的谷蛋白聚合體分子量較大，稱之為谷蛋白大聚合體（GMP），其含量反映了谷蛋白聚合體的粒度分布。研究發現谷蛋白大聚合體含量越高，面筋的強度和彈性越大。

小麥面粉生產及產品加工質量的高低與籽粒蛋白質含量及其數量密切相關。其中，醇溶蛋白和麥谷蛋白的組成、含量和比例影響著小麥面筋的品質。麥谷蛋白決定面筋的彈性，醇溶蛋白決定面筋的黏性和延展性。麥谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋并以一定的比例結合時，才共同賦予面團特有的性質。不同小麥品種麥谷蛋白和醇溶蛋白的含量和比例不同，從而導致面團彈性和延展性的差異。近幾年發現一種半胱氨酸殘基含量高冗余的新型小麥籽粒蛋白Avenin-like蛋白，該類蛋白以其富含半胱氨酸（cys）殘基之特性被廣泛關注。由于半胱氨酸（cys）是形成蛋白質二硫鍵的基礎，其位置及數量影響二硫鍵的形成。因此，對Avenin-like蛋白的深入研究將對分子水平小麥品質改良具有重要意義。

濟麥229、濟麥44和濟麥22為山東省農業科學院作物研究所育成的小麥品種，其中濟麥229和濟麥44為優質強筋小麥，其高分子量麥谷蛋白亞基組合均為（1，7+8，5+10），在首屆黃淮麥區優質小麥鑒評會上均被評為超強筋小麥品種（全國僅4個）。濟麥22為高產、廣適、中筋小麥品種，其高分子量麥谷蛋白亞基組合為（7+8，4+12）。本研究以這3個小麥品種為試材，分析其籽粒發育期谷蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白聚合體的形成規律，確定影響小麥面筋品質性狀形成的關鍵時期，了解品質性狀形成的分子機制，并通過TMT蛋白組學分析3個小麥品種成熟籽粒貯藏蛋白的量及優質強筋小麥中貯藏蛋白的差異，為我國小麥品質改良和優質小麥生產提供技術參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試優質強筋小麥品種濟麥229、濟麥44以及高產、中筋小麥品種濟麥22，由山東省農業科學院作物研究所小麥遺傳育種團隊育成并提供，于2018-2019年種植在山東省農業科學院作物研究所小麥育種試驗基地（濟南）。于小麥開花期掛牌標記開花一致的單穗200個，花后每5天取標記穗20個，取籽粒晾曬，保存備用。籽粒磨制采用FOSS旋風式磨。

1.2測定指標及方法

1.2.1蛋白含量測定利用丹麥福斯1241公司生產的近紅外谷物分析儀測定。

1.2.2籽粒GMP含量測定

稱取250mg面粉置于50 mL離心管中，加入0.5%（W/V） SDS-0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.9） 23 mL，渦旋振蕩20s，至完全分散，再用恒溫混勻儀30℃下以1000r/min攪拌5min，恒重后以11600×g離心力、30℃離心30min，棄上清液，所剩沉淀于115℃烘至絕干后稱重。烘干后的沉淀用MM400冷凍研磨儀研磨，采用杜馬斯定氮儀測定籽粒GMP含量。

1.2.3醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取及含量測定

醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取參考楊學舉的方法。取0.1g面粉樣品置人離心管中，加70%乙醇10mL，充分攪拌后振蕩20min，4000r/min離心5min，取上清，同樣方法共連續提取3次后合并上清液轉入50mL容量瓶中定容，待測醇溶蛋白。麥谷蛋白用0.5%KOH提取，方法過程與提取醇溶蛋白相同。采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。

1.2.4成熟籽粒不同類型貯藏蛋白量的測定3個品種成熟籽粒貯藏蛋白量的測定采用TMT蛋白測定技術．由杭州景杰生物科技股份有限公司完成。

1.3數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2010處理數據和作圖。

2結果與分析

2.1強筋小麥籽粒醇溶蛋白的積累動態

對3個小麥品種醇溶蛋白的含量進行分析（圖1）發現，籽粒發育過程中其醇溶蛋白的積累動態均呈持續上升的變化趨勢?；ê?～15天，隨灌漿時間推進，籽粒醇溶蛋白含量增速較快，花后15～25天增速稍平緩，花后25～35天增速又加快?？傮w來看，整個籽粒灌漿期，強筋小麥濟麥44和濟麥229的醇溶蛋白含量均高于中筋小麥濟麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基類型上看，整個籽粒灌漿期，5+10亞基組合的醇溶蛋白含量均高于4+12亞基組合。

2.2強筋小麥籽粒麥谷蛋白的積累動態

對3個小麥品種麥谷蛋白的含量進行分析（圖2）發現，籽粒發育過程中麥谷蛋白的積累動態呈上升趨勢，花后5～10天，濟麥44的麥谷蛋白含量增速較快，花后10～35天增速稍下降，但麥谷蛋白含量持續增長?；ê?～20天，濟麥229的麥谷蛋白含量增速較20～35天的增速低?？傮w來看，整個籽粒發育時期，強筋小麥濟麥44和濟麥229的麥谷蛋白含量始終高于中筋小麥濟麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基組成類型看，5+10亞基組合的麥谷蛋白含量在整個籽粒灌漿期均高于4+12亞基組合。

2.3強筋小麥籽粒GMP的積累動態

對3個小麥品種GMP含量進行分析（圖3）發現，籽粒發育過程中強筋小麥的籽粒GMP含量呈持續上升趨勢，中筋小麥呈“下降一上升一下降一上升”趨勢。具體看，花后5～15天濟麥44籽粒GMP含量增速較快，花后15～25天增速緩慢，花后25～35天增速上升。濟麥229籽粒GMP含量的增加趨勢與濟麥44相似，但其第二次高速增加期出現在花后30～35天。與強筋小麥不同的是，濟麥22在小麥籽粒發育過程中，GMP含量出現兩次持續下降期，分別為花后5～15天和花后25～30天，兩次持續上升期在花后15～25天和花后30～35天?？傮w來看，在整個籽粒發育期間，強筋小麥濟麥44、濟麥229的GMP含量持續增加且高于濟麥22。從高分子量麥谷蛋白亞基類型上看，5+10亞基組合的GMP含量在整個籽粒灌漿期持續增加，且灌漿中后期的含量均高于4+12亞基組合。

2.4強筋小麥成熟籽粒中的貯藏蛋白種類及相對含量分析

由結果（表1）可以看出，3個小麥品種共檢測到53個貯藏蛋白，分為三類，包括醇溶蛋白27個、Avenin-like蛋白16個和麥谷蛋白10個。3個小麥品種的貯藏蛋白相對含量不盡相同。53個貯藏蛋白中有18個在濟麥229中的相對含量高于濟麥22，其中醇溶蛋白P18573和P04726在濟麥229中的相對含量是濟麥22的3.58倍和4.21倍，Avenin-like蛋白AOA34IY3HO和A7XUQ5在濟麥229中的相對含量是濟麥22的9.21倍和3.18倍，麥谷蛋白P10387在濟麥229中的相對含量是濟麥22的3.87倍。53個貯藏蛋白中有33個在濟麥44中的相對含量高于濟麥22，其中Avenin-like蛋白A7XUQ5在濟麥44中的相對含量是濟麥22的3.79倍，麥谷蛋白P10387在濟麥44中的相對含量是濟麥22的4.07倍。

3討論與結論

小麥食品品質受籽粒蛋白與面筋蛋白含量的顯著影響。籽粒貯藏蛋白在灌漿過程中逐漸積累，其積累動態表現出一定的規律性。本研究顯示，籽粒醇溶蛋白含量和麥谷蛋白含量在籽粒灌漿期持續上升，這與前人研究結果相同。張容研究指出，5+10與2+12亞基組合的品質差異來源從蛋白質組分形成上看，主要是醇溶蛋白和麥谷蛋白后期的快速積累不同。本研究發現，濟麥44和濟麥229（5+10）的醇溶蛋白和麥谷蛋白均在花后20天之后較濟麥22（4+12）快。這與張容的研究結果相似。

谷蛋白大聚合體（GMP）是麥谷蛋白的重要組成部分，是衡量小麥加工品質的指標之一。鄧志英等發現，不同筋型小麥的GMP積累動態存在顯著差異，強筋小麥花后10天便處于較高水平，成熟時GMP含量高于其它筋型小麥。本研究發現，籽粒灌漿過程中，強筋小麥GMP含量整體呈上升趨勢，花后5～25天累積較慢，之后快速增多，花后35天含量達到最高；而濟麥22籽粒GMP積累呈現“下降一上升一下降一上升”的趨勢，即花后5～15天含量逐漸降低，之后逐漸增加，花后25天又降低，花后30天始又增加?？傮w而言，籽粒灌漿期濟麥22的GMP含量低于2個強筋小麥品種。這與前人的研究結果相同，說明籽粒灌漿中后期是強筋小麥與濟麥22小麥GMP含量產生差異的關鍵時期。

鄧志英等指出，不同亞基對GMP的積累有不同影響，含5+10亞基對的品種成熟期GMP含量增幅比前期有很大提高。張容指出，5+10亞基組合的小麥品種籽粒灌漿前期GMP占籽粒蛋白質的比例較低，20天后一直維持在較高水平至成熟，說明其GMP主要是在籽粒灌漿中后期形成。本研究發現，5+10亞基組合的小麥GMP含量在整個籽粒灌漿期保持增加趨勢，但濟麥44在花后25天開始增速加大，而濟麥229在花后30天增速加大。說明含有5+10亞基組合的小麥品種之間其GMP積累動態也存在少許差異。

利用TMT技術從3個小麥品種成熟籽粒中共檢測到53個貯藏蛋白，有33個在濟麥44中的相對含量高于濟麥22，有18個在濟麥229中的相對含量高于濟麥22。分析濟麥44比濟麥22含量高的貯藏蛋白發現，其倍數介于1.01～4.07之間，倍數超過2的有2個。濟麥229比濟麥22含量高的貯藏蛋白倍數介于1.02～9.21之間，有5個倍數超過2，且AOA34IY3HO的倍數達到9.21倍。對TMT數據和麥谷蛋白、醇溶蛋白、GMP在3個小麥成熟籽粒中的含量進行分析發現，濟麥44較濟麥22貯藏蛋白含量高的原因是其大多數的貯藏蛋白表達量高，而濟麥229高蛋白含量的原因是部分貯藏蛋白超高量表達。