骨質疏松癥動物模型造模方法的研究進展

趙建棟 郭成龍 柴威濤 任行全 畢煦昆 張效收 劉貝

【摘 要】 骨質疏松癥是一種全球性疾病。動物模型的研究應用為人們研究疾病提供了一種切實有效的方法，病證結合骨質疏松癥動物模型則可以為中醫藥防治骨質疏松癥提供一個可行有效且便捷的機體，避免直接在人體進行實驗而產生如倫理學等一系列問題。收集總結迄今為止有關骨質疏松癥動物模型及病證結合骨質疏松癥動物模型的研究現狀，為研究工作者提供思路。

【關鍵詞】 骨質疏松癥；動物模型；造模；病證結合；證型造模；研究進展；綜述

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是指單位體積正常礦化骨的骨量減少，骨基質及礦鹽平行減少，骨脆性增加，從而易發生骨折的一種疾病，主要病因有內分泌因素、營養因素、藥物因素等。OP患者既有骨質疏松表現又伴隨腰背疼痛、骨折、駝背、功能障礙。OP可分為原發性和繼發性兩種，原發性OP主要是指退行性骨質疏松，可分為Ⅰ型（絕經后骨質疏松）和Ⅱ型（老年骨質疏松），繼發性OP主要包括疾病、藥物或其他原因導致的骨質疏松［1］。運用導致OP的病因可以指導科研工作者進行OP動物造模，比如切除小鼠雙側卵巢可復制絕經后OP，小鼠腹腔注射D-半乳糖可以復制衰老導致的老年性OP，長期使用大劑量糖皮質激素、腿尾固定、鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病大鼠的糖尿病骨質流失等可復制繼發性OP。

1 OP的概況

1.1 中醫學對OP的認識 中醫學將OP歸屬于“骨痿”“骨痹”范疇［2］，認為腎虛是根本，脾虛是主要病機，血瘀是病理產物。按照2020《中醫藥防治原發性骨質疏松癥專家共識》［3］將OP分為陽虛證、肝腎陰虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證、脾胃虛弱證和氣滯血瘀證6個證型。

1.2 病證結合動物模型常用觀察指標 OP造模的觀察指標有甲狀旁腺激素（PTH）、活性維生素D、降鈣素、骨性堿性磷酸酶（BALP）、Ⅰ型膠原N端前肽（PINP）、骨鈣素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP 5b）等［1］。OP新型炎癥指標：中性粒細胞/淋巴細胞比率（NLR）、全身免疫炎癥指數（SII）與OP、單核細胞/淋巴細胞比率（MLR）、血小板/淋巴細胞比率（PLR）［4］。動物OP在骨微結構改變的基礎上腎陰虛表現為形體消瘦，大便干結，小便赤黃，自主活動增加等；腎陽虛表現為拱背蜷曲，畏寒喜暖，肛溫降低，反應遲鈍，呼吸深遲，毛發干枯，消瘦，尿液清長等；脾腎陽虛表現為毛發無光澤，掉毛現象，爪甲顏色變淺，大便較稀軟，甚者如水狀等。

2 常規OP動物造模方法

2.1 手術方法

2.1.1 手術去勢法 女性因卵巢功能減退致體內雌激素水平降低，導致一系列細胞因子分泌失調，使得成骨與破骨平衡打破，最終誘發絕經后骨質疏松（PMOP）［5］，用手術方法摘除實驗動物單側或雙側卵巢，可以模擬絕經后OP動物模型［6］。此法為最常用的PMOP造模方法，可以很好地模擬OP，缺點是直接切除雙側卵巢導致實驗動物雌激素驟降，與實際PMOP不符。為了避免出現這種現象，切除單側卵巢不失為一種改良方法，這種改良也存在實驗動物體內雌激素驟降的問題，但相對于切除雙側稍有緩和。手術去勢法會對實驗動物造成創傷，比如感染，影響實驗結果，此時可考慮使用抗生素，但會導致腸道菌群紊亂。有人研究腸道菌群與OP相關［7］，使用抗生素亦可影響實驗結果。手術后實驗動物可能因疼痛導致廢用，使用鎮痛藥物亦或對實驗產生影響。手術去勢法雖是目前PMOP常用造模方法，但其缺點也較為顯著。人類罹患疾病是長期而復雜的過程，想得到相對完美的模型將需要長期的探索過程。

2.1.2 坐骨神經切斷法 通過手術方法切斷模型動物的單側或雙側坐骨神經可有效建立廢用性骨質疏松癥（DOP）［8］。

2.1.3 脊髓切斷法 脊髓損傷（SCI）常伴有骨盆和下肢病變區域的OP，增加骨折的風險，通過手術行椎板切除術，將脊髓完全橫切可復制DOP［9］。

2.1.4 臂叢神經切除法 黃昌釗等［10］將兔一側全臂叢神經于鎖骨下鏡下分離至神經根孔處切斷，造模后發現肱骨骨密度、干重明顯降低，骨的力學強度指標較對照側明顯減弱，表明切除臂叢神經可以模擬DOP。

坐骨神經切斷、脊髓切斷、臂叢神經切除均可模擬DOP，DOP是因為骨骼機械負荷力的減少而引起局部或全身骨量丟失［11］，為OP病因之一。通過手術方法使得模型動物骨骼機械負荷力減少從而模擬DOP，但是這3種方法也都使用手術，上述手術對OP的影響均有可能發生。

2.1.5 甲狀旁腺切除法 甲狀旁腺主要功能是分泌PTH，PTH可增強腎小管和腸道對體內鈣的重吸收能力，體內鈣和磷的代謝平衡被破壞，導致骨質溶解［12］。洪志勇等［13］實驗證明，切除雙側甲狀旁腺可致大鼠OP。這種手術難度高，不確定性因素多，相關報道較少，能參考的文獻也較陳舊。

2.2 藥物方法

2.2.1 非手術去勢法 此方法與手術去勢法都使得機體雌激素下降，導致PMOP，可以很好地模擬絕經后OP動物模型［14］。此種方法雖然消除手術因素構建PMOP，但藥物的使用也會對實驗結果產生影響。

2.2.2 糖皮質激素法 糖皮質激素是導致OP的重要原因之一，長期大量使用糖皮質激素可導致成骨細胞的破壞、破骨細胞被活化及減少腸道對鈣磷的吸收［15］。采用灌胃、注射糖皮質激素或皮下植入緩釋糖皮質激素藥物，通過給予影響動物內分泌功能的藥物抑制生理狀態下的雌激素分泌，建立OP模型［16］。袁雪梅等［17］給予雄性Wistar大鼠肌內注射潑尼松龍，祝佳音等［18］給予小鼠臀部肌內注射地塞米松，通過注射糖皮質激素均使得實驗動物發生OP。運用糖皮質激素可以很好地模擬藥物源性OP，使用這種方法的人數較多，相關文獻比較齊全，此種方法已相對成熟，可以合理使用。

2.2.3 D-半乳糖模型 D-半乳糖可以導致機體衰老，腹腔注射D-半乳糖，可以復制衰老導致的OP［19］。模擬老年性OP的想法較少，這是相對常用的一種，研究老年性OP藥物的科研工作者可以選擇此種方法。

2.2.4 維甲酸模型 維甲酸灌胃造模［20］，維甲酸可降低正常人成骨細胞活性，抑制成骨細胞的增殖［21］，刺激破骨細胞使其活性增強［22］。

2.2.5 谷氨酸單鈉法 谷氨酸單鈉能夠選擇性損害動物下丘腦弓狀核神經元，導致神經內分泌調節功能紊亂，誘發骨小梁厚度及數量減少，進而導致骨量減少、骨結構顯著破壞等OP表現，這類OP在學術上被稱作腦源性OP［23］。

2.2.6 乙醇法 乙醇會導致間充質干細胞過早衰老，長期大量使用乙醇也可以構建OP模型［24］。

2.3 物理方法

2.3.1 X射線 X射線照射則導致細胞有絲分裂的不同階段均有損傷［25］。

2.3.2 γ射線 電離輻射會導致卵母細胞丟失和卵巢萎縮，使卵巢功能喪失，可模擬圍絕經期OP［26］。

采用X、γ射線輻射方法，破壞卵巢功能，使動物模型處于圍絕經期，消除了手術、藥物等因素的影響而成功模擬PMOP。

2.3.3 外固定法 有學者采用喇叭型套筒套入左、右后肢根部，觀察到大鼠股骨的骨小梁體積變小，骨礦物質含量等指標顯著下降，成功建立OP模型［27］。

2.3.4 懸吊法 又名腿尾固定，后腿抬高頭朝下傾斜30°，人為造成動物失重或者模擬失重狀態，使骨質水平降低，鈣磷代謝處于負平衡，最終導致骨質丟失［27］。

外固定法和懸吊法單純使用物理方法模擬DOP，消除了手術、藥物等因素的影響。

2.4 其他方法

2.4.1 吸煙 有研究顯示，戒煙可降低骨量的減少［28］，機體過度吸入煙草會對骨代謝產生有害影響，易患OP。FRANCO等［29］研究發現，將Wistar大鼠在吸煙箱中被動吸煙可致大鼠OP。

2.4.2 基因 超過100種目的基因參與OP發生、發展過程，采用基因敲除法可構建OP動物模型［30］。

2.4.3 鐵超載法 有研究通過注射枸櫞酸鐵銨，將機體暴露于高鐵環境下可誘導成骨缺陷，培養出快速、穩定的斑馬幼魚和成魚的OP模型，可廣泛用于未來的OP藥物篩選［31］。

2.4.4 鏈脲佐菌素法 鏈脲佐菌素可以誘導1型糖尿病大鼠的糖尿病骨質流失，可在鏡下觀察到大鼠骨小梁密度降低［32］。

2.4.5 冬眠熊 有學者研究DOP時對冬眠熊進行相關研究，提出冬眠熊在冬眠期間為何不發生OP的疑問。DONAHUE等［33］研究發現，冬眠熊在冬眠期間每天會發生身體顫動4～5次，這種輕微的機械運動可防止OP的發生，破壞這種機械運動可致冬眠熊患OP。

3 病證結合OP動物模型方法

病證結合動物模型是指將實驗動物通過一定的實驗方法構造出既符合西醫學疾病的常規特點，同時又符合中醫學證候特點的特殊造模方法［34］。具體方法是用常規的OP動物造模方法構造出大家所公認的西醫學OP，再通過中醫證型造模方法構造出OP中醫證型。目前常規的OP動物造模方法甚多，病證結合OP動物模型較少，僅有腎陰虛、腎陽虛、脾腎陽虛3種。腎陰虛表現為形體消瘦、大便干結、小便赤黃、自主活動增加等，有研究者給小鼠灌服甲狀腺片混懸液，注射地塞米松后小鼠會出現形體消瘦、大便干結等癥狀［35］，表明小鼠腎陰虛模型已經建立。小鼠注射氫化可的松可表現為拱背蜷曲、畏寒喜暖、肛溫降低等腎陽虛癥狀［36］，大黃瀉下法可致小鼠毛發無光澤、掉毛現象、爪甲顏色變淺、大便較稀軟，甚者如水狀等脾腎陽虛癥狀［37］。利用OP常規造模加中醫證型造模方法可建立病證結合OP動物模型。

3.1 腎陰虛 夏炳江等［38］采用手術去勢法切除昆明小鼠雙側卵巢，再給小鼠每天灌服甲狀腺片混懸液，之后成功復制OP腎陰虛病證結合模型。夏炳江等［39］用地塞米松單一因素構建OP腎陰虛小鼠模型，該實驗模型組注射地塞米松后注射生理鹽水，藥物反證組注射地塞米松后以六味地黃丸混懸液灌胃，模型組小鼠出現了典型OP病理學表現。模型組出現煩躁不安，活動頻繁，毛發枯槁、無光澤、易脫落，飲水增多，小便赤黃等類似陰虛的表現，而藥物反證組小鼠則表現良好，從而反證出地塞米松可致小鼠腎陰虛，用地塞米松這一單一因素既致小鼠OP又致小鼠腎陰虛。

3.2 腎陽虛 陳劍磨等［40］用手術去勢法切除昆明小鼠雙側卵巢后間隔7周，按25 mg·kg-1皮下注射氫化可的松1周，8周時OP模型和腎陽虛造模同時結束。觀察到昆明小鼠出現骨小梁排列稀疏、變細、微骨折等OP臨床表現，同時出現了畏寒倦臥、精神萎靡、反應遲鈍、體質量下降等腎陽虛證候，證明成功建立了OP腎陽虛模型。曹端廣等［41］用維甲酸灌胃、氫化可的松臀部肌內注射的方法構建腎陽虛OP病證結合動物模型，選取SD大鼠，將維甲酸和質量分數為1%的羧甲基纖維素鈉混合，持續2周按每日80 mg·kg-1灌胃，并同時每日按2 mg·kg-1臀部肌內注射氫化可的松，模型復制成功后觀察到模型組大鼠有神疲、發力、靜臥、小便多等腎陽虛表現，且與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠骨密度顯著降低，證明成功建立了OP腎陽虛模型。

3.3 脾腎兩虛 鄭洪新等［42］證實切除卵巢可造成腎虛型OP動物模型。李燕舞等［43］證實大黃瀉下法可致大鼠脾虛。劉梅潔等［44］則在前者基礎上先切除大鼠卵巢，在用質量分數為200%的大黃濃煎液灌胃，同時得到脾腎兩虛OP動物模型。鄧強等［45］先用手術去勢法切除大鼠卵巢，再注射氫化可的松加番瀉葉灌胃加飲食失節加勞倦過度的方法復制脾腎陽虛OP模型。造模5周后大鼠出現大便清稀如水狀、爪甲顏色變淡、毛發枯槁無華、尾巴發涼、弓背蜷臥、喜好抱團扎堆等脾腎陽虛癥狀，且模型組大鼠血清骨堿性磷酸酶含量低于正常組和假手術組，提示模型組大鼠患OP，說明用此法也可成功構建脾腎陽虛OP動物模型。

4 小結和展望

OP動物模型的建立為探究發病機制、病理研究、臨床藥物的開發應用提供了很好的機體，使對OP的認識更加清晰。雖然OP造模方法眾多，但是又各有弊端，不能完全模擬人體各種OP，所以科研工作者們應當集思廣益，繼續發掘OP造模方法。中醫藥雖然對OP有獨特的優勢，但是在當代大環境下，優勢沒有完全展現出來，就如上述OP有多個中醫證型，但病證結合動物模型只有腎陰虛、腎陽虛和脾腎陽虛3個模型。目前，中醫證型造模方法較多，是否可以按上述病證結合的原理，盡可能多進行一些造模實驗，進一步挖掘中醫藥的優勢。我們當實事求是對一些有瑕疵的方法進行改進，并繼續創新方法，以求最理想的動物模型。

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收稿日期：2022-12-10；修回日期：2023-01-08

基金項目：甘肅省自然科學基金項目（18JR3RA074）

作者單位：1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

通信作者：郭成龍