基于不同去袋期分析紅皮梨花青苷合成酶及相關因子

張馳 穆凱代斯罕·伊薩克 吳俊杰 上杰 張琦

摘要：為探明不同去袋時期半紅梨的果實品質表現及重要指標，明確參與調控半紅梨著紅色的關鍵酶，探討果皮花青苷積累機制。以庫爾勒香梨、新梨7號果實為試驗材料，利用正交偏最小二乘判別分析、隸屬函數法對果實品質進行綜合評價并挖掘2個品種的重要指標；再利用動態網絡熱圖明確調控半紅梨著色的關鍵酶，并對花青苷積累的機制進行分析。結果表明，外在品質中去袋時間越晚2個品種果皮表面越光潔，效果越顯著；而紅度上新梨7號以不套袋最佳，香梨則以30 d去袋處理果實紅度達到最高；2個品種b*則套袋處理的黃藍指數均高于對照處理。套袋可減少果實質量，2個品種分別于采前25、20 d去袋處理硬度最低，分別為3.96、7.33 N；內在品質中維生素C含量2個品種均以采前15 d去袋處理含量最低，而其他各處理間均無顯著性差異。新梨7號固酸比以采前25 d去袋最佳，而糖酸比則以對照組最高，為46.85；而香梨固酸比及糖酸比均在采前25 d進行去袋可以使果實香梨糖度達到最高。新梨7號所有處理蛋白質含量無顯著性差異，而香梨以對照組最高，為0.127 8。套袋處理可降低新梨7號UFGT、DFR活性，CHS、CHI活性在采前30 d去袋達到最高，PAL活性在采前25 d去袋處理達到最高。香梨采前25～30 d去袋處理最好，在25 d之后會降低各酶的活性。新梨7號花青苷含量與CHI活性呈極顯著正相關，香梨CHI活性和PAL活性呈顯著正相關，2個品種花青苷合成關鍵酶活性都與可溶性糖、可溶性固形物含量呈顯著正相關。綜合比較香梨不推薦套袋，新梨7號以采前30 d解袋最佳。新梨7號花青苷合成關鍵酶為CHI，香梨花青苷合成關鍵酶是CHI、PAL。研究結果可為新疆紅皮梨的適地適栽及選擇優良品種提供理論依據。

關鍵詞：香梨；新梨7號；去袋；綜合品質；花青苷

中圖分類號：S661.204??文獻標志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0147-07

基金項目：新疆生產建設兵團財政科技計劃（編號：MSSS201903）。

作者簡介：張?馳（1998—），男，新疆阿勒泰人，碩士研究生，主要從事果樹栽培生理研究。E-mail：1030713591@qq.com。

通信作者：張?琦，碩士，教授，主要從事果樹栽培生理生態方面的研究。E-mail：1041805650@qq.com。

果皮色澤是外觀品質最直觀的表現，但梨果實花青苷合成與積累規律較為復雜，不同種和品種果皮內花青苷濃度變化規律有所不同［1］，且同一品種在不同的生長環境條件下著色規律也不盡相同。加上栽培區域的光照、有效積溫及溫差，工人套袋技術以及去袋時間等，都可直接致使梨品質、著色效果等表現不一，都在不同程度上影響了市場競爭力。因此，探明不同相關合成酶促進紅皮梨果實花青苷積累及了解紅皮梨著色規律的機制，可為新疆紅皮梨的適地適栽提供理論依據。我國學者通過對不同梨品種的著色生理研究，明確了部分梨品種的著色規律、相關代謝酶以及套袋等栽培措施促進果皮著色的作用等。如肖長城等對梨紅色果皮的花青苷成分進行了分析［2］；占麗英等指出光照時間越長，對花青苷的合成越有利［3］；藍光和紫外光對花青苷的合成最有效，可以有效提高促進植物呈色的酶活性；張雪等對早白蜜、中熟32及云紅梨1號3個紅皮梨品種不同成熟期果實進行研究，發現花青苷生物合成酶在不同的紅皮梨品種中作用不盡相同，可溶性糖的積累對于花青苷的生物合成有一定的促進作用［4］。早白蜜花青苷合成的關鍵酶為查爾酮異構酶（CHI），而中熟32和云紅梨1號苯丙氨酸解氨酶（PAL）與CHI只參與了花青苷的合成啟動。馮守千等對2個砂梨品種進行套袋試驗，表明套袋主要是調節了CHI的活性，進而影響了花青苷的合成。紅色砂梨PAL、CHI活性變化趨勢一致。但奧冠PAL活性低于滿天紅，CHI活性高于滿天紅［5］。Song等分析發現第4亞群R2R3 MYBs在花青素生物合成調控中發揮重要作用，PbMYB120被鑒定為花青素生物合成的潛在調控因子，在5個梨品種中表達量與花青素積累量呈正相關［6］。劉冰雁分析了蘋果梨不同著色時期花青苷合成差異表達基因，并挖掘出花青苷合成中上調關鍵轉錄因子［7］。

然而我國現有研究對象大多為引進品種或極少數代表品種，對于我國特有梨資源品種研究匱乏，尤其是新疆紅皮梨。因此，本研究以香梨與新梨7號等2個新疆特有紅皮梨品種為試材。用化學計量學方法比較了2種梨品種中14項果實品質指標的定量變化，篩選出重要的指標物質。結合動態網絡熱圖及花青苷合成途徑，明確了紅皮梨品種果皮著色的特點與差異、不同相關酶促進紅皮梨果實花青苷積累的機制。以期為新疆紅皮梨的適地適栽、生產推廣及選擇優良品種提供理論依據。

1?材料與方法

試驗于2021年在新疆塔里木大學梨種質資源圃進行取樣，在南疆特色果樹高效優質栽培與深加工技術國家地方聯合工程實驗室進行測定。

1.1?植物材料和冷處理

供試品種為新疆特有紅皮梨新梨7號（Z）、香梨（C）。2個品種選取長勢中等、產量較一致的6株盛果期樹，于盛花期50 d后開始套袋，采前30、25、20、15 d進行去袋處理，以不套袋為對照；新梨7號編號為Z1、Z2、Z3、Z4、CK1，香梨編號為C1、C2、C3、C4、CK2。各品種果實每次采樣以五點采樣法在樹冠各方位均勻隨機釆樣，每次各處理采30個果實，測得外在品質后，用手術刀剝取1.5 mm左右厚度果皮及果實酮部位置果肉，迅速液氮速凍后-80 ℃保存以供進一步分析。

1.2?果實指標測定

實驗儀器由新疆力德匯科國際貿易有限公司、桂林量具刃具有限責任公司提供。紙袋為鄧州尚源果業梨專用袋（外黃內黑雙層套袋）［8］。

果實外在品質參照牛佳佳等的方法［9］進行測定：電子天平稱量單果質量；電子數顯游標卡尺測量縱橫徑，果形指數用縱橫徑比值表示；果實硬度用果實硬度計測量；果皮色澤采用色差計測量，測量直徑為8 mm，照明為13 mm，以黑色、白色為標準顏色校準［9-10］。

果實內在品質：可溶性固形物含量（%）通過手持折光儀［11］進行測定；蛋白質采用考馬斯亮藍（coomassie brilliant blue）法測定濃度。維生素C含量采用2，6-二氯靛酚滴定法［12］測定；可滴定酸含量參考牛佳佳等采用酚酞指示劑顯色法［9］進行測定。

色素測定：葉綠素、類胡蘿卜素含量采用混合液浸提法，分光光度計測定［13］?；ㄇ嘬蘸坎捎?0 mL 1%鹽酸甲醇溶液浸提法［14］測定。

1.3?花青苷合成酶測定

苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查爾酮異構酶（CHI）、查爾酮合成酶（CHS）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、類黃酮3-0-葡萄糖基轉移酶（UFGT）活性測定均采用酶聯免疫吸附劑（ELISA）法測定，試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供。

1.4?統計分析

采用Origin 2021對生理數據進行統計分析，數據標準化；進一步利用SIMCA14.1進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，簡稱OPLS-DA），并采用投影重要變量VIP值法挖掘重要指標；最后用隸屬函數法［計算公式如下：X（i）=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin），i=1，2，3，…，n。式中Xi表示第i個指標值，Xmax表示第i個指標的最大值，Xmin表示第i個指標的最小值；然后將隸屬函數值進行累加并求平均數］對各項指標進行綜合評價。果皮著色特點與差異、花青苷積累的機制分析則采用在線軟件（https：//www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft）進行。

2?結果與分析

2.1?不同去袋時期果實品質分析

本研究對2個白梨品種進行了試驗。在套袋后，2個品種的生理指標有明顯差異。由表1可知，在外在品質上，套袋處理可以減少2個品種單果質量，且去袋時間越晚，果實質量越低；但果形指數中，新梨7號以對照組最低，而香梨則除采前15 d去袋高于對照處理外均低于對照處理。果實硬度中新梨7號、香梨分別在采前25、20 d去袋最軟，分別為3.96、7.33 N，新梨7號采前25 d去袋處理顯著低于其余處理；香梨采前20 d去袋處理顯著低于采前30 d去袋處理。套袋可以提升果實的亮度指數L*，且果實去袋時間越晚其果實亮度越高，效果越顯著；紅綠指數a*：新梨7號以不套袋處理最高，套袋處理可抑制果皮紅度，去袋時間越晚紅度越低，20、15 d處理果皮均呈綠色；香梨在30 d去袋處理果實紅度達到最高，但與不套袋處理差異不顯著。套袋也可以提升果實的黃藍指數b*，2個品種各套袋處理的黃藍指數b*均高于對照處理，且新梨7號與香梨均以采前25 d去袋最高，分別為41.68和56.66。

由表2可知，套袋對2個品種的維生素C含量影響效果不大，2個品種均以采前15 d去袋處理含量最低，而其他各處理間均無顯著性差異。新梨7號固酸比以采前25 d去袋最佳，而糖酸比則以對照組最高，為46.85；而香梨固酸比及糖酸比均以采前25 d去袋處理最高，在采前25 d進行去袋可以使果實香梨糖度達到最高。新梨7號所有處理蛋白質含量無顯著性差異，而香梨以對照組最高，為 0.127 8，但與采前30、20、15 d去袋處理之間無顯著差異。新梨7號不套袋處理葉綠素a、類胡蘿卜素、花青苷含量均顯著高于套袋各處理；套袋會顯著抑制新梨7號3種色素的表達。香梨葉綠素a、葉綠素b、花青苷含量不套袋處理顯著高于套袋各處理，類胡蘿卜素含量則與30 d去袋處理無顯著差異；香梨套袋會對葉綠素和花青苷含量產生抑制作用。

2.2?果實生理指標綜合分析

利用OPLS-DA繪制模型得分圖對2個梨品種的重要生理指標進行評價（圖1-A）。以模型重要變量投影（VIP）值作為生理指標對引起組間差異的影響強度進行測量，篩選貢獻較大的變量（以VIP值＞1為標準）：單果質量、a*、固酸比、糖酸比是2個紅皮梨品種的重要生理指標。套袋處理下2個品種的指標有明顯的變化，香梨與新梨7號的重要生理指標存在差異（圖1-B、圖1-C），套袋下香梨的重要生理指標為：單果質量、a*、L*和糖酸比；新梨7號的重要生理指標L*、固酸比、單果質量、糖酸比和a*。

2.3?果實品質綜合評價

為比較全面地了解2個品種不同處理的果實品

質，本研究采用模糊數學中隸屬函數法對10個處理進行綜合評價，隸屬函數平均值越大品質越高，反之越差（表3）。新梨7號綜合評價排序為Z1＞CK1＞Z2＞Z3＞Z4，采前30 d去袋果實綜合品質最好；香梨綜合評價排序為CK2＞C1＞C2＞C3＞C4，不套袋處理最佳。

2.4?不同時期去袋對花青苷合成酶活性的影響

新梨7號不同時期去袋對花青苷各合成酶活性的影響存在明顯差異。套袋處理對UFGT、DFR活性的抑制最為顯著，去袋時間越晚其含量整體越低；說明光對UFGT、DFR活性的影響較大，光照時間越長其活性越高。而PAL活性在25 d去袋處理中達到最高，且30 d去袋處理、10 d去袋處理和不套袋處理差異不顯著。CHS、CHI活性在30 d去袋處理中達到最高；CHS活性不套袋處理和其他處理沒有顯著差異，而CHI活性中除30 d去袋處理外，顯著高于其他處理，CHS活性與CHI活性在采前 30 d 去袋可達到最佳值（表4）。香梨中，CHI及UFGT活性在30 d去袋處理中達到最高值，但與不套袋處理無顯著差異；PAL與DFR活性在25 d去袋處理中達到最高值；CHS活性則以不套袋處理最高，但與30 d去袋處理差異不顯著。香梨花青苷各合成酶以采前30 d去袋處理和不去袋處理活性較高，香梨套袋后在采前15～25 d去袋處理對花青苷各合成酶活性影響較大（表4）。

2.5?果實內在品質對花青苷及其合成酶的影響

由圖2-A、圖2-B可知，在果實著色中a*與花青苷含量極顯著正相關，果皮中花青苷含量越高，其紅色程度越深。內在品質中，可溶性糖與可溶性固形物含量與花青苷含量呈顯著正相關，可溶性糖與可溶性固形物含量越多，花青苷的表達就越高。反之花青苷含量與葉綠素、類胡蘿卜素、可滴定酸含量呈極顯著負相關，其含量過高則會抑制花青苷的合成。

花青苷合成的5個相關酶中，CHI、PAL與香梨果皮花青苷含量呈極顯著正相關，其次為UFGT、CHS，表明香梨花青苷合成關鍵酶為CHI與PAL?？扇苄蕴?、可溶性固形物、維生素C含量與CHI活性呈極顯著正相關，PAL活性則與可溶性固形物、維生素C含量呈極顯著正相關；增加可溶性糖及維生素C的含量可以提高CHI的表達，進而有效增加果實紅色程度。新梨7號花青苷合成關鍵酶為CHI，與花青苷含量呈極顯著正相關；CHI活性與可溶性糖、可溶性固形物、維生素C含量呈極顯著正相關，在果實著色期間可以適當噴施三者的外源物來增加CHI的表達進而促進果實著色。

3?結論與討論

在新疆梨業生產上，套袋不僅可以有效調控果皮色澤，亦能改善梨果實的口感品質與營養品質［15］。史夢琪等對梨果套袋處理后，發現果面亮度和飽和度均有不同程度增加［16］。區善漢等研究表明，套袋可解決果皮著色差的問題并可以有效提高果面亮度、增加果面紅綠色度和色澤飽和度［17］。本試驗結果支持了套袋可改善果皮色差L、b*值增加著色效果的觀點。而新梨7號套袋處理后a*仍以不套袋最佳，香梨采前30 d去袋處理與不套袋無明顯差異。其原因可能與地區、溫度、光照時間及強度或品種屬性不同有關，而這一結果與王龍等研究結果一致，單獨利用套袋技術不能顯著改善果皮著紅色［18］。

套袋能減少病蟲害及果面的機械損傷等，提升果實內在品質［19］。姜曉艷等表明套袋對外觀品質提高明顯，可溶性固形物與可溶性糖含量變化較小，而可滴定酸含量顯著降低［20］。于強等發現西洋梨品種套袋后外觀品質、內在品質均有顯著改善［21］，但Zeng等研究則發現，套袋果實中可溶性固形物、可溶性總糖含量和果肉硬度大多下降，而且固酸比增大［22］。本研究發現，套袋處理可以減少2個品種單果質量，果實硬度分別以采前25、20 d去袋處理最低；新梨7號果形指數以對照組最低，而香梨果形指數除采前15 d顯著低于對照處理外，其余處理都與對照組無顯著差異。套袋對維生素C含量影響不大；新梨7號固酸比以采前25 d去袋最佳，香梨也是；新梨7號糖酸比則以對照組最高，香梨在采前25 d進行去袋可以使果實糖度達到最高。與前人研究套袋可以提升可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物含量相似，Luo等研究發現套袋果實外觀品質優于不套袋果實［23-24］。

套袋對花青苷合成的影響可分為2個階段，套袋期顯著抑制花青苷的合成，去袋后花青苷迅速合成。有研究明確表明，富麗和富吉2種蘋果陽側果皮中花青素含量分別是相應陰側果皮的1.58倍和1.16倍［25］。夏靜等研究發現，蘋果在去袋后花青苷含量迅速上升，4 d后果皮花青苷含量開始超過對照水平，8 d超過對照處理1倍左右［26］。本試驗發現，花青苷含量在去袋后雖然會有短期內的提升，但會逐漸趨于平穩，最終花青苷含量仍以不套袋最高；這與黃春輝等發現云紅梨1號和美人酥去袋后花青苷含量急速上升，10 d后趨勢變緩［27］，以及趙亞蒙等2年試驗中，與對照相比套袋處理使單體花青苷含量降低了30.47%（2014年）和4.28%（2015年）的結果［28］一致。其原因可能是套袋是通過影響其他物質含量來間接影響花青苷含量，并不能直接作用于花青苷。如陳霞等研究發現，套袋果實去袋后是通過降低其中葉綠素含量，從而提高果皮色澤和著色面積［29］；李秀菊等研究了富士蘋果套袋后果皮花青苷合成與內源激素含量變化的關系，表明套袋是從內源激素方面影響了花青苷的合成［13］。

花青苷合成途徑中相關酶有苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶、查爾酮異構酶、二氫黃酮醇還原酶、類黃酮一糖基轉移酶等［30］。這些酶相互協作，最終完成從花青苷合成前體苯丙氨酸到各種主要色素的合成和轉化過程。有學者認為套袋處理抑制了紫草酚和花青素的生物合成，但促進了原花青素的積累［31］。Zhou等對Kyoho（V. labruscana）采用5種不同顏色袋子為對比，發現白色、綠色和黃色袋子可以顯著增加香豆?；图谆诨ㄇ嘬罩械谋壤?2］。Zhang等在試驗中觀察到采前覆膜和去袋2種處理在試驗開始時均上調了UFGT、CHS基因的轉錄水平，而后DFR、LDOX和F3H的表達亦均有所增強；不套袋的果皮PAL活性呈下降趨勢，而其他2個處理的果皮PAL活性先升高后降低［33］。本研究綜合比較發現，套袋可抑制新梨7號UFGT、DFR活性；PAL活性對照處理除與20 d去袋處理有顯著差異外，與其他處理無顯著差異，CHS活性對照處理與各套袋處理無顯著差異，CHI活性在30 d去袋處理有所增加，其余時間去袋處理均低于對照。在香梨中，套袋對PAL、CHI、UFGT活性影響不大，而CHS活性在20～25 d去袋活性會顯著降低，而DFR活性在20～30 d內去袋均可以顯著增加。

梨果實花青苷的合成途徑是一個復雜的、多因素協同作用的過程，同品種甚至是同一品種的不同發育階段、不同組織結構，這些酶的功能也可能會各不相同。張夢燕等研究發現，果皮中的花青苷積累量與其合成相關的PAL活性達顯著水平［34］。楊俊楓等則認為PAL、UFGT是花青苷合成的關鍵酶［35］。而華星研究發現，花青苷含量與合成相關酶CHS、CHI、DFR、ANS的表達量呈極顯著正相關［36］。本試驗研究發現，新梨7號的花青苷含量與CHI表達量呈顯著正相關，香梨花青苷含量則與CHI、PAL活性呈顯著正相關，認為CHI是2個品種的共有關鍵酶，而香梨中PAL也是影響花青苷合成的關鍵酶。且2個紅皮梨品種關鍵酶皆與可溶性糖、可溶性固形物含量呈顯著正相關，與可滴定酸含量呈顯著負相關。若對紅皮梨品種增色則可以適當增加外源物或酸抑制劑來達到增加花青苷含量、增大果皮著紅色面積的目的。

綜合評價，新梨7號在采前30 d去袋可以使果實總品質達到最佳，香梨以對照處理表現最佳，不建議進行套袋處理。新梨7號是香梨的優質雜交后代，兩者花青苷合成關鍵酶存在相似性與差異性，梨果皮花青苷合成關鍵酶為CHI、PAL，新梨7號為CHI；且兩者均可以從提升果實可溶性糖和可溶性固形物含量，以及抑制類胡蘿卜素、葉綠素、酸的表達這2個方面來促使果實顏色更加鮮艷。

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