百合組培鱗莖一次性成球技術體系的構建

趙乙璉 席夢利

摘要：為簡化百合組培操作流程，減少鱗莖培養基配方的種類，縮短種球繁育周期，滿足企業及種球生產用戶百合繁育的需求，以百合品種“幸運花束”為試材，通過對百合組培生長過程中的溫度、光照等培養環境及激素、蔗糖、培養基等進行優化，并結合實際生產進行了篩選。結果表明，25 ℃條件下有利于百合鱗莖的發育，溫度過高（≥30 ℃）或過低（≤15 ℃）都會嚴重抑制鱗莖的生長；而在光照培養過程中，全暗培養不僅有利于鱗莖的發育，而且節約能源，更能滿足實際生產的需求；在激素組合誘導鱗片成芽及促進鱗莖發育的過程中，6-BA和NAA依然是百合組培的最佳組合，但在鱗片誘導成芽及小鱗莖發育膨大的過程中，其激素組合濃度雖有差異，但通過對比研究表明6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L激素組合能夠同時滿足百合鱗片不定芽誘導和小鱗莖發育的需求；在蔗糖的添加中，60 g/L的蔗糖濃度有利于百合鱗莖的生長發育，過高易造成鱗莖發育畸形，過低導致營養不足；1/2MS、MS等2種培養基對組培鱗莖根的發育差異性較小、生根狀態都良好，且都顯著好于1/4MS和2MS。研究表明，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0，在25 ℃和全暗條件下培養45 d的百合組培技術體系，可以滿足百合組培規?；瘜嶋H生產的需求，為百合種球繁育提供技術支撐。

關鍵詞：百合；組培；一次性成球；規?；庇?/p>

中圖分類號：S644.104+.3??文獻標志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0162-04

基金項目：國家自然科學基金（編號：31670603）。

作者簡介：趙乙璉（1995—），女，江蘇連云港人，博士研究生，從事植物細胞工程及分子細胞遺傳學研究。E-mail：719591137@qq.com。

通信作者：席夢利，博士，教授，主要從事植物細胞工程及分子細胞遺傳學研究。E-mail：ximenglinjfu@126.com。

百合（Lilium brownii var. viridulum）屬于百合科百合屬，為多年生宿根草本植物［1］。作為世界上最重要的商品和公園花卉，在切花、庭院及公園綠化等方面得到廣泛的應用［2］，有力助推了鄉村產業經濟的發展和美麗中國的建設。近年來，隨著市場需求和種植面積的增加，百合種球的需求量越來越大，但由于百合株芽、種子和鱗片扦插等傳統的繁殖方法存在易帶病、感病、種球品質差等缺點［3］，嚴重制約了百合產業的發展。而百合組培具有保持繁殖系數高、縮短種球繁育周期、種球品質好等特性［4］，有利于百合種球的規?；?、標準化生產及百合新品種的培育。

目前，關于百合組培的報道較多，大多以鱗片、葉片為外植體，通過誘導愈傷、轉化成苗、鱗莖生根等步驟進行并建立了高效的組培體系［5］。但由于所需培養基配方較多，培養周期較長，實際操作過程較為繁瑣，生產的百合組培鱗莖質量參差不齊，因此在繁育過程中難以標準化實施及普及。簡化組培操作流程，減少鱗莖培養基配方種類，構建一次性成球的百合組培技術體系，才能滿足企業及種球生產用戶繁育需求。然而關于百合組培鱗莖一次性成球體系的研究卻相對較少。百合組培鱗莖一次性成球技術體系，就是通過1～2種鱗莖培養基配方，在基本相同的培養環境體系下，培養高品質組培鱗莖的過程。本研究是在傳統百合鱗莖組培的基礎上，通過對溫度、光照等培養環境以及蔗糖、植物生長調節劑、培養基等培養體系的綜合優化和篩選，建立了高效的百合組培鱗莖一次性成球的技術體系，可為百合種球規?；M培擴繁提供技術支撐。

1?材料與方法

1.1?材料與處理

供試百合品種為“幸運花束”，選取無病蟲害、無機械損傷的“幸運花束”種球中層鱗片為試驗材料，用自來水流水沖洗30 min后，先用75%乙醇浸泡搖動30 s，再用0.5%次氯酸鈉消毒10 min，用無菌水漂洗4次后備用。每個試驗重復3次，每個處理5個外植體。試驗于2022年1—12月在南京林業大學林學院進行。

1.2?溫度及光照對百合組培鱗莖發育的影響

把消毒后的百合鱗片接種于培養基（MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.3 mg/L+60 g/L蔗糖，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上，分別在15、20、25、30 ℃ 的溫度和全暗條件下培養45 d，測定其生長變化情況；25 ℃條件下，分別在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗條件下培養 45 d，測定其生長變化情況。

1.3?不同激素組合對鱗片不定芽誘導的影響

把消毒后的百合鱗片，切成約5 mm2的方形小塊，在無菌條件下接種到培養基（MS+60 g/L蔗糖，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上。誘導培養基選擇MS為基本培養基，配合2種激素組合，濃度梯度為 6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）；NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L），正交組合。在25 ℃和全暗條件下培養 45 d，統計不定芽的誘導率以及觀察其生長變化情況。

1.4?蔗糖濃度對鱗莖發育的影響

把消毒后的百合鱗片分別接種于不同濃度蔗糖（0、30、60、90、120 g/L）的培養基（MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上，在25 ℃和全暗條件下培養45 d，測定其生長變化情況。

1.5?不同激素組合對百合鱗莖生長的影響

將鱗片誘導形成的小鱗莖（直徑0.2～0.3 cm）通過繼代培養的方式接種于含有不同生長激素組合的培養基中（MS+60 g/L蔗糖，瓊脂 6 g/L，pH值5.8～6.0），其激素濃度設置梯度分別為 6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L），通過正交試驗組合。在25 ℃和全暗條件下培養 45 d，觀察統計百合鱗莖生長變化情況。

1.6?不同培養基對百合生根的影響

將鱗片誘導形成的小鱗莖（直徑0.2～0.3 cm）分別接種于1/4MS、1/2MS、MS、2MS培養基（6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L，蔗糖60 g/L、瓊脂 6 g/L，pH值5.8～6.0）上，在25 ℃和全暗條件下培養45 d，觀察測定其生長變化情況。

2?結果與分析

2.1?溫度對鱗莖發育的影響

由表1可以看出，在15、20、25 ℃等3種溫度條件下，試管鱗莖生成數量差異較小，而在30 ℃培養條件下試管鱗莖生成數量顯著減少；不同培養溫度下鱗莖質量及直徑均存在差異，以25 ℃條件下形成鱗莖的質量及直徑最大，鱗莖質量由大至小的順序分別是：25 ℃>20 ℃>15 ℃>30 ℃，鱗莖直徑由大至小的順序分別是：25 ℃>30 ℃>15 ℃>20 ℃；15、20、25 ℃等3種培養溫度下鱗莖生根數較多，差異不顯著，而30 ℃溫度下鱗莖生根數很少。通過以上指標可以看出，25 ℃條件有利于百合鱗莖的發育，溫度過高（≥30 ℃）或過低（≤15 ℃）都會嚴重抑制鱗莖的生長發育。

2.2?光照對鱗莖發育的影響

從表2可以看出，在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）條件下，平均每個鱗莖分別有1.5個和2.6個鱗片葉生成，在全暗培養條件下，則只有0.5個鱗片葉生成；全暗條件下形成鱗莖的質量、直徑及每個鱗莖生根數都顯著大于自然光及 3 000 lx 光照16 h—黑暗8 h條件；而自然光由于光照環境差異較大，生成的鱗莖質量大小不一，而在光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗2種培養條件下生成的鱗莖大小比較一致；在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗3種培養條件下鱗莖生成的數量生成的數量無顯著性差異 而在自然光、 光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗2種培養條件下質量卻差異顯著，全暗培養不僅質量大，而且節省能源。因此，全暗培養是鱗莖發育的最佳培養方式。

2.3?不同激素組合對鱗片不定芽誘導的影響

由表3可以看出，百合各激素配比處理間的誘導率差異顯著，但對單個鱗片誘導芽數和幼苗長勢的影響不明顯。當6-BA濃度在0.5 mg/L和 1.0 mg/L 時，鱗片不定芽誘導率都隨NAA濃度增大而相應增加，并在NAA濃度為0.5 mg/L時達到最大，達80.23%，但此時幼苗長勢細弱，無法滿足實際生產的需求，隨著6-BA濃度的繼續增大，當 6-BA 濃度為1.5 mg/L時，鱗片不定芽誘導率都隨NAA濃度增大而減少；而當6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L時，鱗片不定芽誘導率和增殖系數雖然不是最高，但鱗莖發育較好，幼苗生長健壯。

2.4?蔗糖濃度對鱗莖發育的影響

由表4可見，當蔗糖濃度達到30 g/L時形成鱗莖數量最多，平均達4.23個，高于其他蔗糖濃度處理，且每個鱗莖生根數最多，在不含蔗糖的培養條件下幾乎沒有鱗莖形成或形成的鱗莖很??；蔗糖濃度在120 g/L和90 g/L時，生成鱗莖的鮮質量都較大，但每個鱗片上再生鱗莖數量都較少，且都畸形最嚴重，鱗莖發育不正常；只有蔗糖濃度在30 g/L和60 g/L時形成的鱗莖發育正常，而60 g/L的蔗糖條件下形成鱗莖的直徑顯著大于30 g/L條件下形成的鱗莖，故60 g/L的蔗糖濃度有利于百合鱗莖的生長發育。

2.5?不同激素組合對百合鱗莖生長的影響

從表5可以看出，當6-BA的濃度為 0.5 mg/L和1.0 mg/L時，鱗莖鮮質量都分別隨著NAA濃度的增加而增大，當激素組合在6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L時達到最大，為3.8 g，伴隨6-BA的濃度增加到1.5 mg/L時，隨著NAA濃度的增大，鱗莖分球數逐漸增多，但此時，無論NAA濃度的大與小，鱗莖鮮質量都較小。綜合以上分析，6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L的激素組合效果最好。

2.6?不同培養基對百合生根的影響

由表6可以看出，百合鱗莖在這4種培養基上均能生根，但是在生根率、平均根長及根的生長狀態等指標上有所差異。在百合生根培養的過程中，隨著培養基成分比例的增大，生根率和平均根長都呈現先升高后下降的趨勢，其中以1/2MS培養基的生根率和平均根長都最大，分別達到?76.7%?和2.07 cm；1/2MS、MS等2種培養基根的生長狀態顯著好于1/4MS和2MS等2種培養基，且1/2MS、MS等2種培養基在生根率及根長方面差異性較小，生根狀態良好。因此，1/2MS及MS培養基均可作為百合生根的基本培養基。

3?結論與討論

在百合組培繁育過程中，影響百合鱗莖誘導、轉化等的關鍵培養環境及激素種類都已有較多的研究［6-8］。本研究在前人研究的基礎上，對培養基、培養環境等進行了綜合研究和優化，并根據實際生產需求合理選擇培養基及培養環境，優化了培養體系，簡化了繁瑣的培養步驟，并沒有像張進忠等根據培養效果篩選最優培養基及培養環境［9-11］，而是結合生產需求及對鱗莖生長的影響程度合理簡化培養環境及培養基配方。

本研究以百合鱗片為外植體，在培養溫度和光暗培養環境過程中，百合鱗莖容易組培成球，這與前人的研究結果［12-13］較為一致。而在培養基選擇上，通過不同大量元素濃度的培養基篩選，發現MS培養基不僅滿足百合鱗莖的發育，也滿足百合生根的需求，這與Monemi等在生根培養基的選擇上［14-15］不同。作為組培過程中最重要的碳源物質，蔗糖對鱗莖的膨大具有重要的意義，本研究表明適宜的蔗糖濃度為60 g/L，這與前人研究［16］一致，組培鱗莖能正常生長，沒有形成畸形鱗莖，隨著蔗糖濃度的提高，當蔗糖濃度為90 g/L和120 g/L時，組培鱗莖雖比60 g/L蔗糖濃度時要大，但畸形率較高，鱗莖的整體質量下降嚴重。激素對鱗莖的生長發育具有重要的作用，陳麗靜等通過6-BA和NAA的激素組合篩選了從愈傷到鱗莖生長的全過程［17-18］，而本研究則在他們研究的基礎上，通過降低激素濃度組合及優化激素配置，篩選出從鱗片誘導成芽到小鱗莖生長膨大的整個過程。本研究不僅簡化了操作步驟及培養基配方，而且也減少了生根培養基的步驟，直接發育成可以煉苗的百合鱗莖，其效率更高，更適用于企業的規?；?、標準化生產。

本研究通過優化百合培養條件及配方，研究過程中在篩選最優的基礎上，從實際生產需求及百合鱗莖品質等方面綜合考量，建立了更加簡潔高效的百合組培鱗莖一次性成球技術體系，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L，瓊脂 6 g/L，pH值5.8～6.0，在25 ℃和全暗條件下培養45 d。該技術體系不僅減少了不同培養時期培養基的配方，縮短了鱗莖成球的培養周期，而且所組培的小鱗莖也完全滿足實際生產需求。

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