miR-185/YWHAZ軸通過糖酵解調控NSCLC A549細胞凋亡

馬建剛, 王冬, 譚維, 周鳳, 張莉媛

陜西中醫藥大學第二附屬醫院呼吸內科,陜西咸陽 712000

肺癌是臨床常見惡性腫瘤,盡管靶向治療、化療和新型免疫治療技術已廣泛應用,但其5年生存率仍然很低[1]。代謝重編程是癌癥的標志之一[2],腫瘤細胞表現出不同代謝表型,其特征是糖酵解增加和氧化磷酸化減少。有研究發現,隨肺癌進展,葡萄糖和脂肪酸的完全氧化顯著減少,且與晚期癌細胞的乳酸排泄和3H-脫氧葡萄糖攝取增加同時發生,使細胞向糖酵解表型轉變[3]。miRNAs在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的發生發展中起重要作用[4]。臨床研究顯示,miR-185在NSCLC中低表達,可抑制肺癌進展[5]。YWHAZ沉默的卵巢癌細胞明顯抑制了糖酵解[6]。然而,miR-185和YWHAZ之間的關系及其對NSCLC細胞糖酵解的影響尚不明確,基于此,本研究探討miR-185/YWHAZ軸通過糖酵解對NSCLC細胞凋亡的影響,為治療肺癌提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

非小細胞肺癌A549細胞購自武漢博士德生物工程有限公司。所有miRNA mimics、miRNA inhibitor、siRNA和過表達質粒(合成NCBI號為NM_001135699.2的YWHAZ序列后插入PCDNA3.1載體)均由南京金斯瑞公司設計和合成,YWHAZ siRNA序列:5′-AAAGUUCUUGAUCCCCAAUGC-3′,GFP siRNA序列:5′-AAAGUUCUUGAUCCCCAAUGC-3′。PrimeScript RT-PCR試劑盒購自廣州艾基生物技術有限公司。SYBR Premix Ex Taq購自北京斐樂生物科技有限公司。YWHAZ抗體購自深圳市益百順科技有限公司。ECL試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。乳酸和NADH試劑盒購自北京盒子生工科技有限公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海吉至生化科技有限公司。

1.2 細胞培養與處理

人NSCLC細胞系A549在1640培養基中37 ℃、5% CO2條件下培養至60%～80%融合。miR-185相關分組如下:①敲低對照組(轉染無關序列);②miR-185敲低組(轉染miR-185 inhibitor);③過表達對照組(轉染無關序列);④miR-185過表達組(轉染miR-185 mimics)。YWHAZ相關分組如下:①敲低對照組(轉染siGFP);②YWHAZ敲低組(轉染siYWHAZ);③過表達對照組(轉染空載體);④YWHAZ過表達組(轉染YWHAZ過表達質粒)。使用Lipofectamine3000將上述處理因素轉染至A549細胞。糖酵解抑制劑90 μmol/L Phloretin、10 mmol/L Quercetin、2.3 μmol/L STF31、1.3 μmol/L WZB117、5 μmol/L Bromopyruvate、61 μmol/L 3PO、1.5 μmol/L Dichloroacetate、3 μmol/L Oxamic acid、13 mmol/L NHI-1處理A549細胞[7]。

1.3 實時熒光定量PCR

TRIzol法提取細胞總RNA,合成cDNA,采用SYBR Premix Ex Taq在7500 real-time PCR系統上進行實時熒光定量PCR。將cDNA稀釋至1∶20,95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共45循環;40 ℃ 30 s。使用ΔΔCq法計算YWHAZ mRNA相對表達水平。引物序列YWHAZ正向5′-CCTGCATGAAGTCTGTAACTGAG-3′,反向5′-GACCTACGGGCTCCTACAACA-3′;GAPDH正向5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′,反向5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

1.4 免疫印跡法檢測YWHAZ

提取細胞總蛋白,每個樣品孔添加50 μg總蛋白。用12%SDS-PAGE分離蛋白并轉移到硝酸纖維膜上,5%脫脂奶粉封閉膜1 h,TBS洗滌緩沖液清洗2次,與YWHAZ(1∶10 000)、actin(1∶10 000)抗體4 ℃孵育過夜。TBS洗滌緩沖液洗滌后,添加二抗室溫孵育1 h。用ECL試劑盒測定actin和YWHAZ蛋白條帶。

1.5 乳酸、NADH水平的測定

根據文獻[8]方法,使用乳酸和NADH檢測試劑盒,酶標儀570 nm處測量乳酸和NADH光密度(optical density,OD)。

1.6 細胞凋亡水平的測定

A549細胞接種于6孔板上,采用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)雙重標記法檢測細胞凋亡情況。無血清培養基誘導細胞凋亡后,收集所需細胞,PBS洗滌,用膜聯蛋白結合緩沖液重新懸浮細胞。每100 μL細胞懸液中加入Annexin V 5 μL,室溫孵育15 min。5 min后加入PI,流式細胞儀檢測Annexin V和PI陽性細胞數量。

1.7 miRNA高通量測序

提取來自不同糖酵解抑制劑處理后A549細胞總RNA,反轉錄為cDNA以構建miRNA文庫,并由RioBio測序。通過15%Tris-硼酸鹽-EDTA聚丙烯酰胺凝膠獲得18～40個核苷酸的小RNA。PCR擴增產物純化后,使用Illumina Hi-Seq2500平臺進行測序。采用RioBio將干凈的數據與miRBase數據庫中的數據進行比較,計算miRNA的相對表達。

1.8 熒光素酶報告實驗

通過miRDB(http://mirdb.org/)與HumanTargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)在線預測miR-185底物。A549細胞在24孔板上培養,每孔轉染0.5 μg螢火蟲熒光素酶報告質粒、0.5 μg β-半乳酸苷酶表達載體和等量對照質?；騧iR-185 mimics。轉染24 h后,檢測A549細胞中的熒光素酶活性。

1.9 統計學分析

使用Prism 7.0進行統計學分析。組間比較采用單因素方差分析和事后q檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 YWHAZ敲低或過表達效果及溶解曲線

A549細胞YWHAZ蛋白水平敲低YWHAZ后下降,過表達YWHAZ后上升(圖1A)。實時熒光定量PCR檢測YWHAZ的溶解曲線為單峰,說明用于檢測的引物特異性高(圖1B)。

圖1 YWHAZ敲低或過表達效果(A)及溶解曲線(B)

2.2 糖酵解抑制劑對糖酵解酶、乳酸、NADH、細胞凋亡水平的影響

糖酵解抑制劑處理后,乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)、人血小板磷酸果糖激酶(phosphofructokinase platelet,PFKP)和甘油醛-3-脫氫酶(phosphogluconate dehydrogenase,PGD)等糖酵解酶、乳酸和NADH水平均下降,細胞凋亡水平上升(P<0.05;圖2)。

圖2 糖酵解抑制劑對糖酵解酶、乳酸、NADH、細胞凋亡水平的影響a為P<0.05,與對照組比較。

2.3 miR-185對糖酵解酶、乳酸、NADH、細胞凋亡水平的影響

糖酵解抑制劑處理后,miRNA高通量測序發現有45種miRNA表達上調(圖3A)。過表達miR-185時細胞乳酸、NADH水平下降,細胞凋亡水平上升;敲低miR-185時上述變化逆轉(P<0.05;圖3B、C、D、E)。

圖3 miR-185對糖酵解酶、乳酸、NADH、細胞凋亡水平的影響A為miRNA高通量測序結果;B為miRNA過表達篩選影響乳酸的miRNA;C為敲低miR-185后乳酸柱狀圖;D、E為敲低或過表達miR-185后NADH和細胞凋亡柱狀圖。a為P<0.05,與對照組比較。

2.4 miR-185靶向YWHAZ促進細胞凋亡

miRDB和HumanTargetScan在線分析發現,有60個基因可能被預測為miR-185底物,但使用siRNA敲低上述60個基因后,僅敲低YWHAZ時A549細胞乳酸水平下降(P<0.05;圖4)。過表達YWHAZ時細胞乳酸、NADH水平上升,細胞凋亡水平下降;敲低YWHAZ時上述變化逆轉(P<0.05;圖4)。過表達miR-185時,YWHAZ的mRNA和蛋白水平下降,敲低miR-185時上述變化逆轉(P<0.05;圖4)。此外,miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端非翻譯區(UTR)(P<0.05;圖4)。

圖4 miR-185靶向YWHAZ促進細胞凋亡A為siRNA敲低篩選影響乳酸的關鍵基因;B為過表達YWHAZ后乳酸柱狀圖;C和D為過表達或敲低YWHAZ后NADH和細胞凋亡柱狀圖;E和F為敲低或過表達miR-185后YWHAZ的mRNA和蛋白水平;G為熒光素酶報告實驗結果。a為P<0.05,與對照組比較。

3 討 論

肺癌是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤,肺癌患者的5年生存率僅為17.7%,主要是由于腫瘤的快速轉移和局部復發導致[9-10]。因此,有必要深入研究肺癌發生和發展的潛在機制。本研究通過使用糖酵解抑制劑、miRNA高通量測序、遺傳學方法鑒定了miR-185/YWHAZ軸在NSCLC細胞凋亡和糖酵解中的重要作用。

本研究發現,糖酵解抑制劑處理后,糖酵解酶、乳酸、NADH水平下降,細胞凋亡水平上升。代謝重編程是癌癥的標志[2],能量代謝分為糖代謝、蛋白質代謝和脂肪代謝[11-12]。在正常情況下,細胞主要通過有氧呼吸產生能量。當氧含量不足時,細胞進行糖酵解產生能量[13],這個過程稱為無氧呼吸。與正常細胞不同,腫瘤細胞即使在有氧條件下也主要通過糖酵解產生能量,這種現象稱為Warburg效應[14]。糖酵解的特點是生產能量快,效率低。腫瘤細胞的快速增殖需要快速能量消耗,同時,糖酵解產生的乳酸為腫瘤細胞創造了一個酸性環境,有利于腫瘤細胞的快速增殖和生長。因此,糖酵解抑制劑處理后,細胞乳酸水平下降并伴隨了細胞凋亡水平上升。

本研究發現,過表達miR-185時,YWHAZ的mRNA和蛋白水平下降,miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端UTR。miRNA是非編碼的小RNA,長度為18～23個核苷酸,通過與mRNA的3′端UTR結合,在轉錄后調節基因表達[15]。因此,在NSCLC細胞中,miR-185通過靶向降解YWHAZ的mRNA來發揮其生物學功能。

本研究發現,敲低YWHAZ時A549細胞的乳酸、NADH、細胞凋亡水平上升。YWHAZ影響多種重要的細胞過程,例如代謝、信號轉導、細胞凋亡和細胞周期調節[16]。臨床研究證實,YWHAZ的過表達與多種腫瘤的預后呈負相關[17]。研究表明,YWHAZ調節細胞代謝過程[18]。例如,YWHAZ與6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶的心肌同工酶結合,表明YWHAZ參與調節糖酵解和代謝[19]。此外,人乳腺上皮細胞中YWHAZ的增加上調了LDHA表達,提高糖酵解活性并促進早期轉化[20]。在YWHAZ過表達的人乳腺上皮細胞中敲除LDHA可顯著降低糖酵解活性并抑制轉化。因此,YWHAZ可能成為多種腫瘤的預后標志物和治療靶點。

然而,本研究仍然有不足之處。首先,本研究只使用了一種細胞株A549,miR-185/YWHAZ軸是否在其他NSCLC細胞株發揮調控細胞凋亡的功能需要進一步驗證。其次,本研究是細胞水平的研究,miR-185在體內是否抑制NSCLC糖酵解值得進一步探討。糖酵解產生的乳酸為所有種類的腫瘤細胞創造了一個酸性環境,并促進了腫瘤細胞增殖,因此miR-185/YWHAZ軸是否在所有腫瘤細胞中發揮功能是下一步的研究方向。

綜上所述,YWHAZ是促進糖酵解的關鍵分子,miR-185是抑制糖酵解的關鍵分子。糖酵解抑制后,NSCLC細胞凋亡水平上升。miR-185靶向YWHAZ mRNA的3′端非翻譯區,減少了YWHAZ的表達,促進了NSCLC細胞的細胞凋亡。以上提示,針對miR-185/YWHAZ軸NSCLC藥物的篩選和開發具有一定的應用前景。