西藏自治區入侵植物曼陀羅葉綠體基因組通用引物篩選

陳永豪

摘 要 近年來，曼陀羅在我國呈迅速蔓延之勢，已被劃分為入侵植物。入侵植物會壓制或排擠本地物種，破壞當地生態系統多樣性。研究入侵植物的葉綠體基因組遺傳多樣性對了解入侵植物的入侵機制具有重要意義，而利用葉綠體基因組通用引物對葉綠體基因組進行擴增是研究葉綠體基因組遺傳多樣性的有效方法。為加強曼陀羅葉綠體基因組的遺傳多樣性、單倍型分析及譜系地理學等研究，利用查找相關文獻得到的15對葉綠體基因組通用引物對曼陀羅葉綠體基因組非編碼區片段進行擴增，共篩選出7對葉綠體基因組通用引物可以用于曼陀羅葉綠體基因組非編碼區片段的擴增和后續的測序工作。

關鍵詞 入侵植物；曼陀羅；葉綠體基因組；通用引物；西藏自治區

中圖分類號：S567.21 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.02.077

曼陀羅（Datura stramonium Linn.）是茄科曼陀羅屬一年生草本植物，原產于墨西哥，主要分布在溫帶與熱帶地區，在我國各地區均有分布[1-2]。曼陀羅常被當作觀賞植物栽培，曾作為藥用植物引入我國，但由于長期缺乏規范性的入侵檢疫等原因，曼陀羅在我國大范圍蔓延與擴散，目前已被劃分為入侵植物[3-6]。曼陀羅具有很強的化感作用，能夠抑制黃瓜、小麥、蘿卜等作物的生長，對棉花、豆類、薯類、蔬菜和玉米等作物有不利影響，易給被入侵地的生物多樣性與生態環境帶來潛在危害。葉綠體是一種廣泛存在于高等植物和一些藻類中的半自主細胞器，是細胞進行光合作用的主要場所。葉綠體基因組作為直系同源基因，其不易受到旁系同源基因的干擾、在被子植物中遺傳方式為母系遺傳、不易發生重組、便于組裝的特點使其具有易解析的特性，被廣泛應用于植物的系統發育分析、物種鑒定、葉綠體基因工程、分析演化路徑及遺傳進化等研究。目前，有關曼陀羅的研究主要涉及曼陀羅的傳粉生物學研究、曼陀羅在重金屬污染下的種群遺傳結構研究、曼陀羅種子萌發和幼苗生長及關于曼陀羅作為藥用植物有效成分的提取和活性成分的評價等，關于分布于西藏自治區的曼陀羅葉綠體基因組通用引物篩選的相關研究還未見報道。本文通過查找相關文獻，得到15對葉綠體基因組通用引物，利用聚合酶鏈式反應（PCR）對分布于西藏自治區的曼陀羅葉片DNA進行擴增，旨在篩選出能夠用于后續測序及進一步分析曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性、單倍型、譜系地理、系統發育和遺傳分化等研究的葉綠體基因組通用引物，為進一步揭示曼陀羅的入侵機制及防控措施的制訂提供基礎數據和科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 曼陀羅葉片

結合曼陀羅的生長環境特點，于2020—2021年夏天在西藏自治區朗縣、尼木縣、白朗縣、加查縣、南木林縣、波密縣、貢嘎縣、八宿縣、芒康縣、工布江達縣、察隅縣、仁布縣、林芝市、山南市和拉薩市等地的花壇、垃圾堆、荒地及住宅附近，采集曼陀羅新鮮的嫩葉置于預先準備好的分子袋中，并將分子袋迅速放到藍色變色硅膠中對葉片進行快速干燥，并及時更換變質為紅色的藍色硅膠直至葉片完全干燥。

1.1.2 葉綠體基因組通用引物

通過查詢葉綠體基因組通用引物相關文獻，選擇其中15對通用引物（見表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 曼陀羅葉片DNA的提取

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP321進行曼陀羅葉片DNA的提取，操作步驟如下。

1）取完全干燥的曼陀羅葉片約20 mg，與鋼珠一起加入2 mL離心管中做好標記，放到FastPrep-24中充分研磨。

2）在離心管中加入400 μL緩沖液FP1和6 μL的

RNase A（分解RNA），在渦旋振蕩儀上振蕩1 min，然后在室溫下放置10 min。

3）在離心管中加入130 μL緩沖液FP2，充分混勻后在渦旋振蕩儀上振蕩1 min。

4）將離心管置于高速離心機中，以12 000 r·min-1的轉速離心5 min后，用移液槍吸取200 μL上清液轉移至新的離心管中并做好標記。

5）向上清液中加入140 μL異丙醇，充分混勻后在高速離心機中以12 000 r·min-1的轉速離心2 min，然后將上清液舍棄，保留沉淀。

6）加入600 μL質量濃度為70%的乙醇，在渦旋振蕩儀上振蕩5 s后，在高速離心機中以12 000 r·min-1

的轉速離心2 min，舍棄上清液，保留沉淀。

7）重復操作步驟6。

8）打開離心管的管蓋，在室溫下倒置10 min，徹底晾干乙醇，避免對后續的PCR反應造成影響。

9）加入200 μL洗脫緩沖液TE，在65 ℃水浴鍋中水浴10 min，期間不斷進行顛倒混勻，以溶解DNA，最后得到DNA溶液。

1.2.2 DNA質量檢測

曼陀羅葉片DNA提取完成后，對DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察條帶清晰度，確定DNA的質量是否達到標準，將質量達到標準的DNA進行分裝，用于后續PCR擴增反應的DNA放置于-20 ℃冰箱中保存，其余DNA放置于-80 ℃的冰箱中進行保存。

1.2.3 曼陀羅葉綠體基因組通用引物的篩選

在不同退火溫度（55 ℃、52 ℃、50 ℃、48 ℃、45 ℃）下，用15對引物對曼陀羅葉片DNA進行PCR擴增，以篩選出曼陀羅葉綠體基因組通用引物。

1）PCR反應體系的配制。PCR反應體系共計

50 μL，分別為1 μL DNA、2 μL正向引物、2 μL反向引物、25 μL Taq PCR MasterMix、20 μL ddH2O。

2）PCR反應程序的設定。根據生工生物工程（上海）股份有限公司提供的退火溫度將退火溫度設置為55 ℃、52 ℃、50 ℃、48 ℃、45 ℃。PCR反應程序為：①94 ℃預變性3 min；②94 ℃變性30 s；③退火溫度下維持30 s；④72 ℃延伸1 min；⑤步驟②～④循環30次后72 ℃下保存5 min。

3）PCR擴增產物的檢測。吸取5 μL PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳結果置于凝膠成像分析儀下進行拍照記錄，篩選5個退火溫度下出現擴增條帶的通用引物。

2 結果與分析

5個退火溫度下，15對葉綠體基因組通用引物PCR擴增產物的檢測結果如表2所示，出現單清晰帶表示該引物可以擴增出單一清晰的特異性條帶，能夠用于曼陀羅葉綠體基因組的擴增和后續的測序工作；出現無帶、多條帶、單條帶不清晰則表示該引物擴增出來的條帶不具有單一性和特異性，不能用于曼陀羅葉綠體基因組的擴增和后續研究。

由表2可知，5個退火溫度下，從15對葉綠體基因組通用引物中共篩選出7對可擴增出單清晰帶的引物。其中在退火溫度55 ℃條件下，僅引物5可擴增出單清晰帶；退火溫度50 ℃條件下，引物1、引物2、引物3、引物4可擴增出單清晰帶；退火溫度48 ℃條件下，引物14可擴增出單清晰帶；其余引物在5個退火溫度條件下均未擴增出單清晰帶。

此外，7對引物擴增曼陀羅葉綠體基因組的區域分別為trnL-trnF、trnT-trnL、atpB-rbcL、trnS-psbC，

其中引物2、引物3、引物5、引物14分別在退火溫度50 ℃、50 ℃、55 ℃、48 ℃條件下擴增出trnL-trnF，

說明曼陀羅葉綠體基因組片段trnL-trnF在不同的引物及退火溫度下均易擴增出清晰的特異性條帶，而其他擴增區域只在特定退火溫度及特定引物下才能擴增出特異性條帶，trnL-trnF更適用于曼陀羅葉綠體基因組后續研究。

3 結論與討論

21世紀以來，入侵生態學研究成為全球熱點之一[13]。隨著生物入侵現象越來越嚴重，由生物入侵造成的生態資源破壞和經濟損失也越來越大，嚴重影響著被入侵地的生態安全、經濟發展和人類健康等[14]。曼陀羅作為一種入侵植物，研究其葉綠體基因組的遺傳多樣性對了解曼陀羅的入侵機制進而制定科學的防控措施具有重要意義，而對曼陀羅葉綠體基因組部分片段進行測序是進行曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性等研究的有效方法，其中篩選曼陀羅葉綠體基因組通用引物可為后續測序和曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性等方面的研究提供基礎數據。

本文通過查詢相關文獻獲得15對葉綠體基因組通用引物，對曼陀羅葉綠體基因組非編碼區進行PCR擴增，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發現有7對引物在相應的退火溫度下能夠擴增出單一清晰的特異性條帶，其中曼陀羅葉綠體基因組片段

trnL-trnF在不同引物和退火溫度下均易擴增出特異性條帶，更適合用于曼陀羅葉綠體基因組非編碼區的擴增和后續的測序工作，對后續研究入侵植物曼陀羅葉綠體基因組的遺傳多樣性、單倍型分析及譜系地理學分析具有重要意義。

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（責任編輯：劉寧寧）