人參藥材抗氧化活性的研究

孫仁爽，趙敏婧，隋艷艷，谷偉強

（1.通化師范學院醫藥學院長白山天然藥物重點實驗室，通化 134002；2.梅河口市食品藥品檢驗檢測中心，梅河口 135000；3.吉林省通化振國藥業有限公司，通化 134002；4.遼寧參中堂健康產業股份有限公司，本溪 117221）

人參是一種珍貴的中藥材，具有較好的抗氧化活性?；钚匝踝杂苫芍苯踊蜷g接造成 DNA 損傷，導致染色體和 DNA 鏈斷裂。因此，如何清除氧自由基是中西醫科學領域亟待解決的問題。人參、三七和西洋參中的主要有效成分均為皂苷類化合物[2]。研究表明，人參皂苷具有多種生物活性，幾乎可作用于人體的各個生命系統。人參皂苷類化合物具有清除自由基的作用[3]，但人參皂苷是一種較弱的自由基清除劑，此特性在聯合用藥中有利于人參皂苷抗自由基作用的緩慢釋放[4]。近年研究中多采用 Fenton、Haber—Weiss 等紫外分光光度計法進行分析。本文采用 DPPH 法分析皂苷類化合物清除自由基的能力，用 DPPH 法檢測抗氧化活性是比較成熟的抗氧化活性評價方法[5]?？寡趸锟梢耘c人參皂苷直接結合，DPPH 的顏色將會從紫色變為淡黃色，通過顏色的變化[6]，檢測吸光值。吸光度的變化可以直接反映出人參皂苷的抗氧化活性。

1 儀器與試劑、試藥

1.1 實驗儀器

BIOBASE-EL10C 酶標儀，博科 Biobase；DF-Ⅱ加熱式磁力攪拌器，北京六一儀器有限公司；離心機，江蘇圣力離心機制造有限公司；BT243S 電子天平，北京賽多利斯儀器系列有限公司；中藥粉碎機，北京旭鑫儀器設備有限公司；超聲波清洗器，深圳市潔盟清洗設備有限公司。

1.2 實驗試劑、試藥

甲醇、DMSO、DPPH 均為分析純；人參藥材經通化師范學院張立秋副教授鑒定為五加科植物人參的干燥根及根莖，產地分別為清河鎮、撫松縣、黑龍江省尚志市。

2 實驗方法與結果

2.1 實驗方法

2.1.1 人參皂苷提取

取人參根及根莖，切成 1～2 cm 的小段，加水煎煮兩次，第一次煎煮 2 h，第二次煎煮 1.5 h，煎煮液濾過，合并煎煮液，通過 D101 型大孔吸附樹脂柱，水洗脫至無色，收集水洗液，再用 60%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮成浸膏，分離純化藥材中的人參皂苷，凍干后配制成梯度濃度的樣品檢測液，利用 DPPH 法鑒定樣品檢測液的抗氧化能力。

2.1.2 抗氧化能力的檢測

將不同編號的樣品檢測液分別加入至 96 孔板內，體積為 100 μL，迅速加入 DPPH 溶液 100 μL。DPPH 溶液配制，稱取 0.0158 g 樣品，乙醇完全溶解后定容至 100 mL，離心后，避光靜置 20min，利用分光光度計檢測其在 515 nm 波長的吸光值，空白對照組為水，陽性對照組為 Vc。

自由基清除率=(1-Ai/A0）×100%

2.2 結果與分析

2.2.1 不同產地人參藥材抗氧化分析

DPPH 法檢測抗氧化活性是比較成熟的抗氧化活性評價方法?？寡趸锟梢耘c人參皂苷直接結合，DPPH 的顏色將會從紫色變為淡黃色，通過顏色的變化，檢測吸光值，根據吸光度的變化可以直接反映出人參皂苷的抗氧化活性。由圖1 可知，在 1～15 mg/mL 試驗范圍內，隨著樣品濃度的增加，對 DPPH 的清除能力也會增加，與同等條件下的陽性對照 Vc 相比，二者具有顯著的抗氧化活性。說明該方法能夠檢測出人參有效成分對 DPPH 的清除效率，進而反映出人參的抗氧化活性。

圖1 自由基清除率與濃度的線性方程

基于以上，進一步檢測了不同產地同一年限人參的抗氧化活性，詳見圖2。由于撫松三年人參的回歸曲線 r 值較小，沒有統計學意義，現僅探討黑龍江尚志三年和清河三年人參藥材的自由基清除率與濃度的關系。將數值分別帶入兩個回歸曲線方程可得到，DPPH 清除率達到 50%時，黑龍江尚志三年人參 IC50值為 16.2 mg/mL，而清河三年人參的 IC50值為 20.3 mg/mL。說明黑龍江尚志三年人參的抗氧化活性高于清河三年人參。

圖2 不同產地人參皂苷自由基清除率與濃度的回歸方程

2.2.2 不同年限人參藥材抗氧化分析

為了準確地檢測出撫松人參的抗氧化活性，本實驗選取二年、四年的撫松人參做進一步檢測。通過對回歸曲線方程的代入計算可得，兩種年限的撫松人參都有較強的抗氧化活性，其中四年撫松人參的 IC50在6mg/mL。

為了檢測不同年限人參藥材的抗氧化能力，選取來自同一產地，同一品種，不同年限的人參藥材，分離純化得到皂苷之后凍干，配制成不同梯度濃度的樣品溶液，同樣利用 DPPH 法對人參皂苷的抗氧化能力進行測定。由圖3 可知，撫松人參的抗氧化活性隨著年限的增長而顯著提高。為了進一步確認抗氧化活性與人參年限的關系，選取了清河不同年限人參以及黑龍江尚志不同年限人參作為材料，進行抗氧化活性檢測。

圖3 撫松不同年限人參皂苷自由基清除率與濃度的回歸方程

通過對回歸曲線的帶入計算可得，清河十二年人參的 IC50值為 5.7 mg/mL，清河六年人參的 IC50值與十二年人參比較接近，遠低于清河五年、清河四年以及清河三年人參。說明清河人參隨著年限的增加，抗氧化活性也會隨之提高，清河五年人參以及以后年限的人參抗氧化活性不會隨著年限增長而顯著提升。詳見圖4。

圖4 清河不同年限人參總皂苷清除率與濃度的回歸方程

為了進一步確認不同年限人參抗氧化活性與濃度的關系，選擇了黑龍江尚志三年、黑龍江尚志五年、黑龍江尚志八年人參以及林下參 25 年為材料。通過對回歸曲線的帶入計算可得，林下參 25 年的 IC50值遠遠低于其他年限的黑龍江尚志人參，最低為 6.0 mg/mL，黑龍江尚志三年，黑龍江尚志五年和黑龍江尚志八年人參隨著年限的增長，其 IC50逐步降低。說明其抗氧化活性與其年限具有正相關性。詳見圖5。

圖5 黑龍江不同年限人參皂苷自由基清除率與濃度的回歸方程

3 討論

本研究選取清河、撫松、黑龍江尚志等地所產人參，提取人參根及根莖總皂苷，以 Vc 作為抗氧化活性的陽性對照，檢測人參的抗氧化活性，其中在 1～15 mg/mL 試驗范圍內，隨著樣品濃度的增加，對 DPPH的清除能力也會增強，與同等條件下的陽性對照 Vc相比，二者均具有顯著的抗氧化活性。說明該提取方法能夠檢測出人參皂苷對 DPPH 的清除效率，進而反映出人參的抗氧化活性。為了進一步鑒定不同產地人參的區別，選取了撫松三年，清河三年以及黑龍江尚志三年人參作為實驗材料，進行抗氧化活性的檢測。結果表明，三種人參的抗氧化活性確實存在差異，說明同一品種不同產地，其抗氧化活性具有一定的差別。隨后，又鑒定了同一產地不同年限人參的抗氧化活性差異。首先檢測了撫松兩年，三年和四年人參的抗氧化活性，發現撫松四年人參的抗氧化活性明顯優于撫松兩年和三年。同樣的方法，進一步鑒定了清河不同年限人參及黑龍江尚志不同年限人參的抗氧化活性，得出的結論是在一定年限內，人參的抗氧化活性會隨著年限的增長而提高[7]。

綜上所述，DPPH 法能夠準確快速地檢測人參皂苷的抗氧化活性。不同產地的人參藥材，人參皂苷的抗氧化活性存在一定的區別[8]。而在不同年限的人參藥材檢測實驗中發現，無論是撫松人參、清河人參還是黑龍江尚志人參，生長年限越長的人參藥材其抗氧化活性也越高，說明不同年限的人參抗氧化能力有差異，隨著年限的增長，人參的抗氧化能力會隨之增強。