東北野生榛子葉中鞣質成分的提取工藝研究

王碩，盧慧，車環宇*

（1.通化師范學院醫藥學院，通化 134002；2.通化醫藥健康職業學院，通化 134002）

榛子，又稱山板栗，主要含有鞣質、揮發油、有機酸、黃酮等成分，其中鞣質含量尤為豐富，而榛子葉中含量最高。鞣質具有抑制細菌、抵抗病毒、抗誘變、抗過敏等生物活性，在醫藥、化妝品、食品等工業中被廣泛應用[1]。榛子葉廉價易得，對其進行研究開發具有重要意義。

1 實驗材料、儀器與方法

1.1 實驗材料

榛子葉采于黑龍江省哈爾濱市郊帽兒山；丙酮為分析純；對照品：沒食子酸、磷酸、磷酸二氫鉀均為分析純；甲醇、乙醇、乙酸乙酯均為色譜純；重蒸餾水。

1.2 實驗儀器

超聲波振蕩提取器；旋轉蒸發儀 N-1000；HPLC；水浴鍋 SB-200；AL 系列溶劑過濾器；循環水真空泵SHB-95；中草藥粉碎機。

1.3 實驗方法

實驗采用丙酮-水體系，進行正交試驗，最佳工藝確定為 1∶12 g·mL-1的 70%丙酮，在 100KHz 超聲頻率下超聲提取 60min。

高效液相色譜法測定榛子葉中沒食子酸含量，沒食子酸標準品在 λ=280nm 條件下檢測，在 0.08～6.48μg 范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為 y=2523.6x-28.652，r=0.9999。榛子葉中總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物沒食子酸的含量分別為0.99%、3.94%、0.14%(n=6)。

2 方法與結果

2.1 榛子葉鞣質提取分離

多酚類化合物具有多個酚羥基和游離羥基，極性較強。傳統方法提取植物多酚，常用水和乙醇作為提取溶劑，提取效率低，溶劑用量大，一些極性較小的成分難以被完全提取。由于鞣質在酸、堿、高溫等條件下不穩定，報道提取方法的文獻不多。榛子葉中藥理活性成分較多，不同的提取工藝直接影響其藥效。超聲的選擇性高、穿透力強，超聲技術能極大的加快反應速度，減少反應時間，應用于植物細胞破壁時，可以有效增加收率。因為丙酮-水對鞣質的提取率高，而且減壓蒸發很容易將丙酮從提取液中去除，剩下鞣質的水溶液，所以，采用丙酮-水體系進行超聲提取?？傳焚|的提取一般用 Me2CO-H2O (5∶5～7∶3)。本實驗選用70%丙酮為溶劑，對榛子葉中的總鞣質進行提取分離。通過 HPLC 法以沒食子酸含量為指標，對 9 種不同提取工藝提取的榛子葉鞣質含量進行測定，擬選出提取榛子葉中鞣質的最佳工藝。

2.1.1 提取分離

采用不同溶劑用量、不同超聲時間和不同超聲頻率提取榛子葉中的鞣質成分，用高效液相法測定榛子葉中總鞣質含量，從而確定最佳提取工藝。

2.1.2 正交優化實驗

因素水平設置為料液比 (A)、超聲時間 (B)、超聲頻率 (C)。由于鞣質對熱的不穩定性，故選擇提取溫度為室溫。以上三個因素各設置三個水平，因素水平安排見表1。

表1 因素和水平表

2.1.3 實驗結果

分別取 9 份 10g 的榛子葉，以丙酮提取榛子葉總鞣質含量作為考察指標，按照 L9(33)正交表條件進行實驗，用 HPLC 色譜法以沒食子酸為標準對照品，測定各實驗總鞣質中沒食子酸含量，結果表2。

表2 L9(33)正交表及實驗結果

經方差分析得優化結果，詳見表3。

表3 正交實驗方差分析

分析結果表明，B 因素的水平變化對實驗結果無顯著影響；A、C 因素的水平變化對實驗結果具有較顯著影響。所以提取工藝的最佳條件為 A3B2C3，即在 100KHz超聲頻率下用液料比為 1∶12 g·mL-1的 70%丙酮超聲提取 60min，得到榛子葉總鞣質含量為 0.99%(n=6)。

2.2 HPLC 法測定榛子葉總鞣質及不同萃取部位中沒食子酸的含量

沒食子酸是可水解鞣質后的產物，在各種可水解鞣質的提取過程中均可得到。目前，《中國藥典》采用紫外分光光度法以沒食子酸為對照來測定鞣質的含量。因此，采用 HPLC 色譜法測定沒食子酸含量，從而對榛子葉鞣質提取物進行初步的確定。

實驗儀器：色譜柱，美國迪馬公司 C18柱 (4.6mm×200nm，5μm)；檢測波長，λ=280nm；流速：1.0mL·min-1；流動相：磷酸 (0.01mol·L-1)-磷酸二氫鉀 (0.01mol·L-1)-乙醇-乙酸乙酯 (42.5∶42.5∶10∶5)。

2.2.1 線性關系考察

精密稱取沒食子酸對照品，甲醇配制濃度分別為0.02、0.06、0.18、0.54、1.62 mg·mL-1的溶液。標準品溶液均為 4μL。依照上述色譜條件進樣，測定峰面積。沒食子酸在 0.08～6.48μg 范圍內呈良好的線性關系(見圖1)。繪制標準曲線時，沒食子酸進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程：y=2523.6x-28.652，r=0.9999。標準品的 HPLC 標準曲線圖譜，詳見圖2。

圖1 線性關系圖

圖2 標準品沒食子酸含量的HPLC 譜圖

圖3 榛子葉總鞣質沒食子酸含量的HPLC 譜圖

圖4 榛子乙酸乙酯萃取物沒食子酸含量的HPLC 譜圖

圖5 榛子正丁醇萃取物沒食子酸含量的HPLC 譜圖

2.2.2 精密度實驗

精密吸取 0.12mg·mL-14μL 沒食子酸對照品溶液，連續進樣 6 次，計算出 RSD 值為 1.02%。

2.2.3 重現性實驗

分別取榛子葉 6 份，各約 0.6g，按上述提取分離項操作，分別測得榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物 RSD 值依次為 1.64%、1.35%、1.76%，表明該方法重現性良好。

2.2.4 穩定性實驗

分別取榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的同一供試品溶液，在 0、4、8、12、24h 各測定一次，進樣量 10μL。在 24h 內，榛子葉總鞣質 RSD 值為 1.82%，正丁醇萃取物 RSD 值為 2.28%，乙酸乙酯萃取物 RSD 值為 1.79%，表明三種供試品溶液在 24h內基本穩定。

2.2.5 加樣回收率實驗

精密稱取榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物各 9 份，均 1.5g。每種待測品平均分成 3 組，分別加入相當于待測品總量 80%、100%、120%的沒食子酸，依照上述內容操作，計算回收率。榛子葉總鞣質的平均加樣回收率為 97.43%，RSD 值為 1.86%；乙酸乙酯萃取物的平均加樣回收率為 100.73%，RSD 值為 1.24%；正丁醇萃取物平均加樣回收率為102.36%，RSD 值為 1.84%。

2.2.6 樣品測定

采用提取榛子葉總鞣質的最佳工藝，減壓濃縮(40℃)，用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇濃縮液分次萃取，減壓回收 (40℃)，濃縮至恒重，分別得到榛子總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物三組樣品，備用。分別精密稱取 0.1mg 干燥的榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物粉末，放置于 25mL 容量瓶中，加入甲醇溶解。榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物的進樣量分別為 10μL，按標準曲線法操作，測定色譜峰面積，計算含量。HPLC 圖譜見 3、4、5。

3 結果與分析

正交設計試驗采用不同溶劑用量、不同超聲時間和不同超聲頻率提取榛子葉中的鞣質成分，再利用HPLC 色譜法對實驗所得成分中的沒食子酸進行含量測定，從而確定最佳提取工藝。

由表1 和 3 中看出，各因素下的水平優勢為 A3＞A2＞A1、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1；由 r 值看出實驗中各因素對實驗結果的重要性依次為 A＞C＞B；最佳工藝條件為 A3B2C3，即用液料比為 1∶12g·mL-1的 70%丙酮，在100KHz 超聲頻率下提取 60min 得到的榛子葉鞣質成分最多。由方差分析得出 B 因素的水平變化對實驗結果無顯著影響；A、C 因素的水平變化對實驗結果具有較顯著影響。

料液比 1∶12g·mL-1的 70%丙酮在 100KHz 超聲頻率下提取 60min，抽濾，減壓回收丙酮后，用氯仿萃取，除去葉綠素，再用乙酸乙酯、正丁醇萃取，干燥后得到榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。用 HPLC 法進行樣品測定，結果得出榛子葉總鞣質中沒食子酸的平均含量 0.99%，RSD=1.04%(n=6)；乙酸乙酯萃取物中沒食子酸的平均含量 3.94%，RSD=1.51%(n=6)；正丁醇萃取物中沒食子酸的平均含量為 0.14%，RSD=0.97%(n=6)。由結果看出榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中所含沒食子酸成分的含量為乙酸乙酯萃取物最高，需在抗氧化實驗中進一步確定各組分的鞣質含量。

4 結論

榛子葉的鞣質含量豐富，為了更好的開發利用，圍繞榛子葉鞣質的提取分離、抗氧化作用及其作用機制為目的進行實驗研究。首先，采用正交實驗法篩選出超聲提取榛子葉中鞣質的最佳工藝，再通過 HPLC法測定榛子葉總鞣質、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物中沒食子酸的含量。

正交設計試驗以料液比、超聲時間和超聲頻率為考察因素，提取榛子葉中的鞣質成分，再利用 HPLC色譜法對實驗所得成分中的沒食子酸進行含量測定，從而確定最佳提取工藝為：料液比 1∶12g·mL-1的 70%丙酮在 100KHz 超聲頻率下提取 60min。由方差分析得出料液比、超聲頻率的水平變化對實驗結果具有顯著影響。