影響透明質酸炎癥反應的因素：雜質、細胞種類和分子量大小

孫欣 王瑞妍

關鍵詞：透明質酸；炎癥；雜質；細胞種類；分子量

透明質酸是一種天然的直鏈聚合物，屬于糖胺聚糖的一種，是細胞外基質的重要組成部分[1]。它由D- 葡萄糖醛酸和N- 乙?；?D- 葡萄糖胺的重復二糖單元組成，通過交替的β-1，3 和β-1，4 糖苷鍵連接，具有親水性[2]。在其天然形式中，透明質酸一般表現為非常長的聚合物，稱為高分子量透明質酸。在某些條件下，高分子量透明質酸可以被分解成小片段，稱為低分子量透明質酸[3]。各種研究文獻對于劃定透明質酸分子量高低并無明確的界限，本文以不同分子量可能介導不同的炎癥反應為依據[4]，認為高分子量透明質酸大于500 kDa，低分子量透明質酸分子量為10 ～ 500kDa，而小于10kDa 則為寡聚透明質酸。

對于低分子量透明質酸和寡聚透明質酸是否有促炎作用已經引發了廣泛的關注和爭議。有研究發現，在受到刺激后的巨噬細胞中加入不同分子量大小的透明質酸后，并不能檢測到任何促炎癥因子、一氧化氮和α 型腫瘤壞死因子（TNF-α） 的產生[5]。另一項研究發現，低分子量和高分子量透明質酸并不會引起腎小球系膜細胞的炎癥反應；但如果采用透明質酸酶來處理加入的透明質酸并使之降解，則會使透明質酸覆蓋的細胞膜表面炎癥因子受體（如TOLL 樣受體） 暴露出來，使得細胞更容易受到促炎分子（如內毒素） 的影響[6]。此外，將低分子量透明質酸（200kDa） 或人重組透明質酸酶加入無內毒素的透明質酸中，兩者之一施用到小鼠皮下氣囊中后，并不會在灶點引發炎癥反應[7]。以上這些結果均不支持低分子量或寡聚透明質酸具有促炎作用的觀點。

另外，透明質酸或其他試劑中的雜質或污染物，被發現可能導致實驗給出誤導性的結果。例如低至5 pg/mL的微量內毒素就可以誘導小鼠樹突狀細胞產生促炎性的白細胞介素-6（IL-6）[8]。目前，有兩種生產工藝可用于獲得商業化的透明質酸：從動物組織中提取，或者通過生物合成的方式獲得。這兩種方法都面臨著使用源自動物或鏈球菌的生物制品安全性問題，而鏈球菌作為一種已知的病原體，會產生內毒素，成為透明質酸的潛在污染源[9]。其他研究者也指出，透明質酸和透明質酸酶（如牛源或溶透明質酸鏈霉菌源等） 是兩個很容易被內毒素污染且被廣泛用于透明質酸炎癥反應研究的試劑[10，11]。透明質酸酶被用于各種分子量透明質酸的降解以獲得小分子片段。如果不對最終測試物質進行內毒素控制和檢測，促進炎癥的結果就可能是由內毒素而非透明質酸導致。如此一來，結論就存在被誤導的風險。已有研究證實，不含內毒素的、由外源性添加的各種分子量透明質酸或者片段化透明質酸在離體小鼠巨噬細胞和樹突狀細胞中均不能引發促炎反應[11]。

本文將基于透明質酸介導炎癥反應的機理，探究雜質、細胞種類和分子量大小對透明質酸介導炎癥反應的影響。

01透明質酸介導炎癥反應的機理

透明質酸根據兩種基本機制發揮其生物功能：（I）作為細胞外基質中的結構分子和（II）作為信號分子[12]。

高分子量透明質酸作為細胞外基質中的結構分子，由于其大分子尺寸、顯著的吸濕性，能夠調節細胞外基質的組織水合作用和滲透平衡，構建一個水合和穩定的細胞外空間，在這里細胞、膠原蛋白以及其他細胞外基質組分得到牢固的維持[11]。高分子量透明質酸有助于維持細胞和組織的穩態。

而當透明質酸與結合分子相互作用時，它也起到信號分子的作用。與透明質酸相關的結合分子主要有兩種：CD44 和CD168 （也稱RHAMM，即透明質酸介導的運動受體）[13]。其他被發現的相關結合分子還包括細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、透明質酸內吞受體（HARE）、淋巴管內皮受體-1（LYVE1）、TOLL 樣受體-2（TLR2） 和TOLL 樣受體-4（TLR4） 等[11，14]。

CD44 作為一種淋巴細胞黏附受體，被廣泛表達在各種免疫細胞表面，參與機體的炎癥反應，炎癥相關的細胞增殖、黏附和遷移，以及血管生成和細胞骨架重排[15]。透明質酸與CD44 的結合力隨著透明質酸分子鏈變長而增加[16]，而當透明質酸的單糖數量低于20 個，與CD44 的結合方式便會發生變化[17]。透明質酸通過與CD44 結合，在細胞表面形成覆蓋膜，該保護層能夠掩蓋住細胞的免疫受體，從而屏蔽掉炎癥因子，防止細胞凋亡[3]。

CD168 存在于細胞表面、細胞質和細胞核中。細胞外側的CD168 與蛋白酪氨酸激酶受體（RTKs） 和非蛋白酪氨酸激酶受體（包括CD44 和CD44-EGFR 復合物） 相互作用，通過激活ERK1/2/MAPK 信號通路介導炎癥反應[12]。透明質酸與CD44 和CD168 的相互作用可以誘導多種細胞行為，包括激活酪氨酸激酶、蛋白激酶C、FAK和PI3K、MAPK、NF-κB 和RAS，以及激活炎癥反應所需的細胞骨架成分[12]。上述細胞行為也可以由CD44 和CD168 各自獨立地與透明質酸相互作用完成[12]。

此外，透明質酸還可以與特定的細胞因子相互作用，從而調節免疫細胞功能。一個例子是白細胞介素-8（IL-8），它在炎癥存在時由成纖維細胞、單核細胞/ 巨噬細胞、內皮細胞和上皮細胞釋放。透明質酸與IL-8 具有較弱的結合力，會降低IL-8 的活性。這意味著透明質酸可以適當屏蔽掉IL-8 引發的免疫反應[18]。

02影響透明質酸介導炎癥反應的因素

影響透明質酸介導炎癥反應的因素，已有研究報道的包括：透明質酸的分子量大小[19]，透明質酸內毒素的含量[10][20]、細胞受刺激的狀態[19]，以及各種細胞種類。

本文對透明質酸在細胞層面的炎癥測試文獻進行了梳理，選擇促炎因子（如TNF-α） 和抑炎因子作為衡量指標，通過匯總透明質酸對兩者是否有顯著的促進或者抑制作用，從而判斷各個因素對透明質酸介導炎癥反應的影響。

2.1 細胞類型對于透明質酸炎癥反應的影響

表 1 總結了免疫細胞（巨噬細胞和外周血單個核細胞）、角質細胞和成纖維細胞，在正常條件和受刺激條件下，透明質酸介導的炎癥反應。具體的數據匯總參見表 2 ～表7。很明顯，不同細胞類型下，透明質酸呈現出不同的炎癥反應。比如，角質細胞對各種分子量的透明質酸都不會產生促炎反應，而這些透明質酸在正常的成纖維細胞中卻很可能引發炎癥反應。值得一提的是，由于寡聚透明質酸對正常角質細胞沒有炎癥反應，而對于炎癥狀態的角質細胞（比如紫外刺激后） 能減緩炎癥反應，因此可能很適合用來涂抹在皮膚表面，用于抗炎修復。

2.2 內毒素含量對于透明質酸炎癥反應的影響

內毒素也被稱為脂多糖（LPS），它是所有革蘭氏陰性細菌細胞壁的內源性成分，對大多數哺乳動物都有“毒性”作用。LPS 是一種非常有效的炎癥反應刺激物，在微克/升的濃度范圍內即可以有生物活性[25，26]。大量關于寡聚、低分子或者片段透明質酸具有促炎作用的文章都是基于透明質酸降解實驗，而降解過程中被廣泛使用的試劑（如透明質酸酶） 或方法容易被內毒素污染，但一些研究并沒有對降解后透明質酸的內毒素進行控制或檢測，這使得所謂寡聚、低分子或者片段透明質酸具有促炎作用時常缺少說服力[27-29]。

內毒素會產生促炎癥反應是公認的事實。根據美國FDA 要求，每件非特殊移植性醫療器械的內毒素上限是20 EU。目前各大透明質酸供應商都會嚴格控制內毒素含量，使之處于安全上限以下。表8 列出了已被報道的透明質酸介導炎癥反應與內毒素含量的關系，由于此處內毒素含量是上限，實際透明質酸的內毒素含量可能遠低于展示的數值，這使得分析內毒素含量與透明質酸介導炎癥反應的關系變得困難和不甚可靠。表8 里列出的最低內毒素上限是0.01EU/mg；在此上限下，依舊發現透明質酸不論分子量大小，都存在促炎反應。另外，從機理上說，相比較高分子量透明質酸，低分子量透明質酸更加無法覆蓋和屏蔽細胞膜上的促炎因子受體，因此相同含量的內毒素在低分子量透明質酸下可能會更容易觸發細胞的炎癥反應。有研究發現，低分子量透明質酸對LPS 處理的軟骨細胞有增強炎癥因子產生的作用，中等分子量透明質酸對LPS處理的軟骨細胞產生炎癥因子沒有影響，而高分子量透明質酸對LPS 處理的軟骨細胞能夠降低炎癥反應[30]。

表8 所示為不同的透明質酸內毒素含量下，加入透明質酸和不加透明質酸后，細胞促炎因子（或相關mRNA 表達） 的變化和抑炎因子（或相關mRNA 表達） 的變化。

03結論

透明質酸介導的炎癥反應，既與透明質酸本身的類型和純度相關，也與試驗研究所用的細胞類型等實驗條件相關。

在角質細胞、外周血單個核細胞、星形膠質細胞[31] 等細胞模型中，無論分子量大小，透明質酸都不會促發炎癥反應。寡聚透明質酸對于UVB 損傷的角質細胞還具有減輕炎癥反應的作用。而在成纖維細胞、巨噬細胞、軟骨細胞[20][32][38]、人細支氣管上皮細胞[33] 等細胞模型下，透明質酸介導炎癥反應則復雜得多。通過整理分析巨噬細胞相關的論文發現，似乎高分子量透明質酸更傾向于抑制炎癥，而低分子量透明質酸則更容易加劇炎癥反應。但是也有研究表明寡聚和低分子量透明質酸并沒有促炎作用[34，35]。巨噬細胞不同的極化（或激活） 狀態對透明質酸會產生不一樣的反應[19]。許多刺激物（如LPS 或干擾素γ） 具有激活巨噬細胞的能力，但即使是具有大致相同表型的刺激物（LPS 或干擾素γ 與LPS） 也會導致不同的細胞激活狀態，進而影響數據結果。諸多巨噬細胞實驗之所以會產生各自矛盾的結論，實驗模型的差異可能是其中一個很重要的原因。

內毒素作為一種容易混入透明質酸的雜質在商業化生產中已經可以被很好地控制在安全上限以下。從發表的研究來看，在使用商業化的透明質酸所做的實驗中，并沒有證據表明內毒素含量與透明質酸介導的炎癥反應存在相關性。但是也有研究表明，相同含量的內毒素在較低分子量的透明質酸中更容易刺激細胞產生炎癥反應。因此，對低分子量或寡聚透明質酸進行更嚴格的內毒素控制顯得很有必要。