變應性鼻炎中lncRNA-miRNA-mRNA網絡構建與相關程序性細胞死亡基因的分析

王宇婷,姜輝,王嘉璽

(北京中醫藥大學東方醫院 耳鼻咽喉科,北京 100078)

變應性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 是耳鼻咽喉科常見疾病之一,屬于機體免疫系統疾病。然而其發病機制的研究仍有不明之處,導致其診斷及針對性治療存在一定的困難。因此,我們迫切的需要進一步研究,并且對AR的生物學機制有更深入的了解。非編碼RNA(ncRNA),包括microRNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環狀RNA(circRNA),在表觀遺傳學、轉錄調控和轉錄后調控中發揮重要作用[1]。越來越多的研究表明lncRNA廣泛參與AR的發生發展過程。lncRNA-miRNA-mRNA所形成的內源競爭RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)調控網絡在免疫疾病中已有廣泛研究。然而,ceRNA網絡與AR的發生發展之間的關系仍不清楚。

Zhang等[2]研究表明FOXD3-AS1在AR患者鼻黏膜中下調,其抑制鼻黏膜上皮細胞(nasal mucosa epithelial cells,NEC)中白細胞介素-25(interleukin-25,IL-25)的表達和分泌,從而調節AR中的輔助性T淋巴細胞2(helper T lymphocytes,Th2)的功能。然而,也有證據表明lncRNA不獨立發揮調節功能,而通過與某些ncRNA競爭性結合相互作用,構建動態的調節網絡,這以前被稱為競爭。ceRNA網絡被認為是解釋轉錄后調控的重要機制[3]。有學者[4]研究發現在AR患者的鼻黏膜組織和IL-13處理的NEC中LINC00632表達下調,并負調節miR-498,從而降低其靶基因白介素1受體拮抗劑(interleukin1 recepter antagonist,IL1RN)的表達,以此來調節巨噬細胞集落刺激因子、嗜酸性粒細胞趨化因子等的表達。然而AR的研究不僅限于此,考慮到程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)在AR中的重要作用,我們根據構建的ceRNA網絡進一步對AR的調控機制進行探討。

本研究選取AR患者與正常人全血樣本進行RNA測序,構建lncRNA介導的ceRNA網絡,對網絡中的mRNA進行基因本體(gene ontology,GO)和KEGG功能富集分析。然后,我們將ceRNA網絡中差異表達的mRNA與PCD相關的基因進行交互作用,并構建lncRNA介導的ceRNA網絡中的PCD相關調控網絡,分析相關基因的靶器官定位。該研究進一步深入挖掘AR發病的新的分子機制,特別是lncRNA介導的ceRNA調控網絡與程序性死亡之間的相互作用。

1 材料和方法

lncRNA介導的ceRNA網絡(lncRNA-miRNA-mRNA)的構建及相關PCD基因分析流程如圖1所示。

圖1 ceRNA網絡的構建與分析流程圖 注:AR(變應性鼻炎);GO(基因本體)。下同。

1.1 患者和樣本收集

1.1.1 一般資料 本研究納入4例AR患者,其中男1例,女3例;平均年齡29.3歲,平均病程2.4年。對照組4例,男2例,女2例;平均年齡30.3歲。兩組均于2021年3月—2021年4月就診于北京中醫藥大學東方醫院耳鼻咽喉科門診,8例患者均久居于北京市。所有對照組均為變應原特異性IgE陰性。研究對象均進行常規檢查及靜脈血采集,所有的血液樣本都取自肘部靜脈。該研究所用標本通過北京中醫藥大學東方醫院倫理委員會批準,并征得患者知情同意。

1.1.2 納入及排除標準 納入標準: ①年齡18～55歲;②符合國內《變應性鼻炎診斷和治療指南》(2015年)中制定的AR診斷標準[5];③免疫印跡法進行的血清變應原特異性IgE(specific IgE, sIgE)檢測陽性,主要對塵螨、動物皮屑、蟑螂或霉菌過敏;④AR病史≥1年;⑤同意參與本研究并簽署知情同意書者。同時符合以上5條者方可納入。

排除標準:①近2周內患呼吸道感染或急性鼻竇炎;②慢性鼻竇炎病史或影像學顯示鼻竇炎;鼻腔手術史或鼻腔器質性病變;③近3個月曾接受過西藥抗過敏治療、中藥治療,可能影響本臨床研究的觀察治療測定者;④合并全身免疫系統疾病、嚴重呼吸系統疾病、血液循環系統疾病、造血系統疾病者;⑤惡性腫瘤患者;⑥精神病患者;⑦妊娠期婦女;符合上述任意一條者均不能入組。

1.1.3 全血樣本采集和保存 應用PAXgene血液RNA管(preanagen,Venlo,荷蘭)采集全血2.5 mL,PAXgene采血管內含能夠穩定體內基因轉錄性狀的抗凝劑以避免RNA快速降解,穩定細胞內RNA。將PAXgene試管小心倒置8～10次,可確保管內保護劑和血液充分混合均勻,在室溫下放置2 h后,大體積干冰運輸至深圳微科盟科技集團有限公司實驗室進行檢測,以減少RNA降解。

1.2 RNA測序分析

1.2.1 全血總RNA提取 在RNA提取前,從干冰中取出試管后,室溫解凍并在孵育2 h。RNA純化按照PAXgene血液RNA試劑盒手冊中的方案進行。利用NanoDrop2000儀(NanoDrop技術公司,威爾明頓,DE,美國)對所提 RNA 的濃度和純度進行檢測,瓊脂糖凝膠電泳測RNA完整性,電泳圖片顯示3條清晰的條帶(28 s/18 s/5 s),RNA完整性良好。Qubit測定濃度。單次建庫要求RNA總量≥1 ug,濃度≥100 ng/μL,OD260/280≥1.8,OD260/230≥1.0。

1.2.2 RNA測序實驗 測序實驗采用Illumina Truseq TM RNA sample prep Kit方法進行鏈特異文庫構建,包括去除rRNA,RNA片段化,反轉成cDNA,連接adaptor即在雙鏈的 cDNA 在3’末端加上一個 A 堿基,連接Y字形的接頭,UNG酶消化cDNA二鏈,文庫富集即PCR擴增,純化得到最終文庫,并由illumina平臺上機測序。lncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt,不編碼 lncRNA的RNA分子。我們基于轉錄組拼接結果,根據 lncRNA 的結構特點以及不編碼 lncRNA 的功能特點,設置一系列嚴格的篩選條件,將篩選所得lncRNA進行后續分析。使用StringTie-eB軟件對lncRNA的轉錄本進行定量分析,得到各樣本的轉錄本readcount 及FPKM信息。同時對測序結果中的mRNA及miRNA進行定量分析,得到readcount 及FPKM值。

1.3 篩選差異表達lncRNA、miRNA和mRNA

采用R軟件中的“DESeq2”軟件包,對AR患者與對照組之間的lncRNA、miRNA和mRNA進行差異表達分析。用P<0.05和|log2FC|>1作為基因表達顯著性差異的篩選閾值。通過使用R軟件中的“ggplot2”、“pheatmap”和“ggrepel”軟件包生成熱圖和火山圖來進行差異基因的可視化。

1.4 lncRNA-miRNA-mRNA網絡的構建

lncRNA-miRNA-mRNA網絡基于ceRNA假設構建:①應用miRmap, miRanda, miRDB, TargetScan和MitarBase數據庫提取miRNA-mRNA的相互作用信息,應用 StarBase數據庫提取 miRNA-lncRNA相互作用的信息;②如果lncRNA和mRNA都被同一個miRNA靶向,并且該miRNA與lncRNA及mRNA表達負相關,則該lncRNA-miRNA-mRNA組被確定為共表達競爭三聯體,故構建相應的ceRNA調控網絡。應用cytoscape 3.7.1軟件對ceRNA調控網絡進行可視化。

1.5 GO和KEGG功能富集分析

對上述步驟中得到的ceRNA網絡中的mRNA進行潛在的生物學功能富集分析。GO富集分析分為分子功能(molecular function, MF)、生物過程(biological process,BP)和細胞組成(cellular component,CC)3個部分;KEGG分析是應用KEGG(京都基因和基因組百科全書)數據庫進行mRNA相關通路的富集分析,利用R軟件中的“clusterprofiler”包預測ceRNA網絡中的mRNA潛在的生物學功能。P<0.05為差異具有統計學意義。KEGG分析應用R軟件中“GOplot”包篩選GO中3個部分的前20個基因集繪制柱狀圖進行可視化;并篩選具有顯著差異的KEGG基因集進行圈圖繪制。

1.6 ceRNA網絡中PCD相關基因的篩選

首先genecards數據庫(https://www.genecards.org)中與PCD相關的基因,包括“程序性細胞死亡”、“細胞凋亡”、“細胞焦亡”相關基因。然后,將ceRNA網絡中差異表達的mRNA與PCD、細胞凋亡和細胞焦亡相關的基因相互取交集。結果通過在線工具Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)生成的Venny圖進行可視化。

1.7 PCD相關基因的ceRNA網絡構建

依據ceRNA假設構建PCD相關lncRNA-miRNA-mRNA網絡,并應用Cytoscape 3.7.1軟件對ceRNA調控網絡進行可視化。

1.8 ceRNA網絡中mRNA與靶器官網絡的構建

AR作為免疫系統疾病其發病機制尚有不明之處,可能有多個組織和器官參與疾病的發生進展。因此,應用BioGPS數據庫(https://biogps.org)在器官組織水平上檢測每個mRNA的表達譜信息[6]。該數據庫提供了通過微陣列分析直接測量基因表達而獲得的基因表達數據[7]。我們首先得到84個器官和組織中每個mRNA表達的分布數據,然后計算每個組織中每個mRNA的平均值和所有組織中的總體平均值[8]。最后,提取mRNA表達量高于總體平均值的相關器官和組織中的前14個靶器官與mRNA通過Cytoscape 3.7.1建立mRNA-靶器官定位網絡。

2 結果

2.1 差異表達的lncRNA、miRNA及mRNA的鑒定

對AR組及對照組全血樣本測序,并對已知序列的lncRNA、miRNA和mRNA進行定量分析,以P<0.05和|log2FC|>1為閾值篩選差異表達的lncRNA、miRNA和mRNA。共鑒定出200個差異表達lncRNA(98個上調,102個下調);201個差異表達mRNA(92個上調,109個下調);14個差異表達miRNA(7個上調,7個下調)。差異表達的lncRNA、miRNA和mRNA的熱圖和火山圖如圖2所示。

圖2 差異表達的lncRNA、mRNA和miRNA的火山圖和聚類熱圖 A:差異表達lncRNA火山圖; B:差異表達mRNA火山圖; C:差異表達miRNA火山圖; D:200個差異表達lncRNA聚類熱圖; E:201個差異表達mRNA聚類熱圖; F:14個差異表達miRNA聚類熱圖 注:紅色表示上調的基因,藍色表示下調的基因;淺綠色表示對照組,淡紅色代表AR組。

2.2 lncRNA、miRNA、mRNA間ceRNA網絡的分析

我們根據堿基序列和表達水平分別預測了lncRNA-miRNA和miRNA-mRNA對?；赾eRNA網絡構建思路,在lncRNA介導的上調ceRNA網絡中鑒定出4對miRNA-lncRNA和22對miRNA-mRNA,包括3個lncRNA節點、2個miRNA節點和22個mRNA節點;在lncRNA介導的下調ceRNA網絡中鑒定出3對miRNA-lncRNA和24對miRNA-mRNA,2個lncRNA節點、2個miRNA節點和24個mRNA節點。見圖3。

圖3 lncRNA介導的ceRNA調控網絡的構建 A:lncRNA介導的上調ceRNA網絡; B:lncRNA介導的下調ceRNA網絡 注:綠色表示LncRNA上調,紅色表示LncRNA下調;淡黃色表示miRNA下調,紫色代表miRNA上調;藍色代表mRNA上調,橘黃色代表mRNA下調。

2.3 ceRNA網絡中差異表達mRNA功能富集分析

為了進一步探索lncRNA介導的ceRNA網絡相關的潛在功能,應用R中的“clusterprofiler”對ceRNA網絡中的mRNA進行功能富集分析。GO分析結果將顯著富集(P<0.05)的前20個GO條目繪制成柱狀圖(圖4A)。結果表明,參與ceRNA網絡中的差異表達mRNA尤其富集于GO:0051924(鈣離子轉運的調節);GO:0070372(ERK1和ERK2級聯的調節);GO:0070371(ERK1和ERK2級聯);GO:0014065(磷脂酰肌醇 3-激酶信號傳導)等生物學進程中。GO:0016323(基底外側質膜);GO:0016324(頂端質膜);GO:0031253(細胞投射膜)等細胞成分中。GO:0016651[作用于 NAD(P)H的氧化還原酶活性];GO:0140375(免疫受體活性);GO:0005178(整合素結合)等分子功能。見圖4B。另外KEGG通路分析表明,ceRNA網絡中mRNA的功能主要富集于hsa04510(粘附斑激酶通路);hsa05235(在癌癥中PD-L1的表達和PD-1檢查點通路);hsa04020(鈣信號通路);hsa04611(血小板活化通路);hsa04151(PI3K-Akt 信號通路);hsa04022(cGMP-PKG信號通路);hsa04621(NOD樣受體信號通路);hsa04060(細胞因子與受體間相互作用);hsa04080(神經活性配體-受體相互作用)。見圖4C。

圖4 ceRNA網絡中差異表達mRNA的功能富集分析 A:ceRNA網絡中差異表達mRNA的GO分析 注:BP(生物過程);CC(細胞成分);MF(分子功能)。X軸:各GO條目;Y軸:校正過的P值(P<0.05表示顯著富集)。紅色表示在AR中該GO生物學功能更有可能上調,藍色表示更有可能下調。B:篩選可能具有臨床意義且顯著富集的10個GO條目繪制圈圖 注:藍色點代表下調基因,紅色點代表上調基因;內圈條狀的高度代表富集基因的數目;內圈條狀的顏色:紅色表示在AR中該GO生物學功能更有可能上調,藍色表示更有可能下調。C:篩選可能具有臨床意義且顯著富集的9個KEGG通路繪制圈圖,用于展示基因的差異倍數與富集到的KEGG通路間的隸屬關系 注:左側代表基因,其中紅色上調基因,藍色代表下調基因;右側代表9個KEGG通路。

2.4 ceRNA網絡中PCD相關基因的鑒定及PCD相關基因的ceRNA網絡分析

我們將ceRNA網絡中的46個差異表達的mRNA與GeneCards數據庫中檢索到14 004個自噬相關基因相互作用,鑒定出ceRNA網絡中存在25個自噬相關基因,于13 473個PCD相關基因相互作用,共獲得25個交集基因;與184個焦亡相關基因相互作用,鑒定出1個交集基因(圖5)。然后,我們對構建了AC008394.1及人類組織相容性白細胞抗原復合物P5(human histocompatibility leukocyte antigen comple P5,HCP5) 2個lncRNA所介導的ceRNA調控網絡,探索其對PCD的調控作用,結果如圖6所示。

圖5 韋恩圖,ceRNA網絡中差異表達的mRNA與PCD、細胞凋亡、細胞焦亡相關的mRNA之間的相互作用 注:PCD(程序性細胞死亡)。下同。

圖6 PCD相關基因ceRNA調控網絡的構建 A:lncRNA介導的下調ceRNA網絡; B:lncRNA介導的上調ceRNA網絡 注:黃色表示lncRNA下調,紅色表示lncRNA上調;淺藍色表示miRNA上調,橘黃色代表miRNA下調;紫色代表mRNA下調,綠色代表mRNA上調。

2.5 ceRNA網絡中mRNA與靶器官定位網絡分析

基因表達數據是基于B和GPS數據庫中的基因表達芯片分析所得。在查找相關mRNA在BioGPS數據庫的表達譜中,NANOGP8和CD247沒有mRNA表達譜。故我們分析了44個mRNA靶蛋白在84個組織和器官中的表達譜,選取前14個靶器官與相應的mRNA構建mRNA-靶器官定位網路,14個靶器官包括小腦、顳葉、松果體、下丘腦、背根神經節、骨髓、CD34+等以神經免疫系統為主的相關組織器官。網絡中包含32個節點和328條邊。大多數靶標同時在多個器官和組織中高表達,表明這些器官與PCD相關ceRNA網絡密切相關,提示其相關作用機制可能與神經、免疫等功能相關。見圖7。

圖7 ceRNA網絡中mRNA與靶器官定位網絡的構建 注:黃色代表基因;綠色代表靶器官。節點大小由degree值決定。

3 討論

AR是一種復雜的疾病,隨著空氣質量日益惡化,人們生活工作壓力的增加及飲食不規律等原因,使得患病人數逐年增加,且部分患者伴發哮喘等下呼吸道疾病,嚴重影響生活質量[9]。雖然常年性 AR患者較少存在生存問題,但疾病所產生的附加影響,如對情緒、睡眠及經濟成本的影響仍值得我們去研究。然而, AR的分子機制尚不清楚,這為疾病的早期診斷及針對性治療帶來困難。

為了更好地認識 AR的發病機制和發現潛在的生物標志物,本研究利用轉錄組測序技術對其進行了定量和全面的分析,包括編碼和非編碼轉錄組。結果顯示,常年性 AR患者與正常人中miRNA、lncRNA和mRNA的表達模式存在顯著差異,而DEmiRNA、DElncRNA和DEmRNA的動態變化也存在顯著差異。近年來,ncRNA 被發現與廣泛的生物調節功能相關[10]。然而,本研究獲得的DElncRNA大多功能未知,這主要是由于對它們的研究較少。因此,我們構建了常年性 AR由lncRNA介導的ceRNA調控網絡?；赾eRNA理論構建了2個lncRNA-miRNA-mRNA調控網絡,包括5個lncRNA、4個miRNA和46個mRNA。lncRNA AC004832.1、AC008394.1、TDRG1、HCP5和CHL1-AS1均首次在 AR患者外周血中被鑒定為差異表達的lncRNA。GO和KEGG富集分析表明,參與ceRNA網絡的DEmRNA在“鈣離子轉運的調節”、“PI3K-Akt通路”和“免疫受體活性”等中顯著富集。在ceRNA網絡與PCD相關基因相互作用后,鑒定到20個lncRNA介導的ceRNA調控通路。另外,將鑒定到的ceRNA網絡中的mRNA進行靶器官定位分析發現,大多數靶標在神經免疫系統為主的相關組織器官中表達。

在上述ceRNA調控通路中,有幾個樞紐節點已被證明在AR及相關免疫細胞中發揮關鍵作用。人類主要組織相容性復合體(human major histocompatibility complex,MHC),也被稱為人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA),覆蓋人類基因組的0.13%,跨越6號染色體短臂6p21位置,該區域包含超過250個注釋基因和假基因[11],lnRNAHCP5基因位于6p21.33區域中,人白細胞抗原HLA I類β區域內的ERV16元件中[12]。在一項關于HCP5與轉錄因子相互作用的研究中,Warner等[13]通過敲除NF-κB1基因失活的研究中發現,HCP5、NOD2和IL-8與細胞活力下降密切相關。同時NF-κB1(位于chr4上)調控他一些MHC基因的表達,從而影響多種生物學功能,包括與炎癥疾病相關的錯誤激活、不適當的免疫細胞發育和細胞生長延遲。且它可以獨立于大多數基因被激活或抑制。另外在探討細胞因子對HCP5表達的影響時發現,在外周血單核細胞中IL-10能夠下調HCP5的表達[14],而IL-10在AR中低表達[15],故推測HCP5可能在AR中表達增高,這與本研究結果一致。

目前對于HCP5通過ceRNA機制發揮作用的研究主要集中在腫瘤研究中,Cheng等[16]在結直腸癌的研究中,應用熒光素酶報告基因分析,結果表明miR-139-5p是HCP5的直接靶點,HCP5通過激活ZEB1并與miR-139-5p相互作用,參與上皮-間充質轉化。Zhang等[17]研究發現HCP5通過靶向miR-140-5p/IGF1R通路促進透明細胞腎細胞癌的增殖和轉移,HCP5作為一種相互競爭的內源性RNA,通過在ccRCC中海綿化miR-140-5p來調節IGF1R的表達。如在肺腺癌的研究中發現蛋白編碼基因CTSS、FGL2和PDL2,miR-106b-5p和miR-17-5b及lncRNAHCP5形成了調控網絡,從而HCP5通過與免疫檢查點基因PDL2和抑制癌變的治療靶點FGL2競爭,參與了肺癌的發生過程[18]。HCP5通過海綿化miR-22-3p、miR-186-5p和miR-216a-5p發揮ceRNA功能,激活ST6GAL2,調節濾泡性甲狀腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲性和血管生成能力,從而促進濾泡性甲狀腺癌進展[19]。

ceRNA網絡中的miRNA是重要的節點,Zhou等[20]通過qRT-PCR檢測患者和小鼠鼻黏膜中miR-31的表達水平發現在AR患者中miR-31水平升高。?emeci 等[21]對鼻息肉組織與鄰近的正常鼻黏膜相比,發現鼻息肉組織中miR-31的平均水平升高,且在氣道上皮細胞中高表達[22]。另有miR-31對免疫細胞作用機制的研究,用miR-31轉染CD4+T細胞可降低IL-2和IL-4的表達水平[23],上述在 AR及氣道炎癥中對于miR-31的研究結果,與本研究結果相同。在花粉季節期間和之外獲取SAR患者CD4+T細胞,使用微陣列分析發現miR-139為差異表達的miRNA,結合共表達分析結果顯示miR-139可能通過調節FOS和JUN影響SAR[24]。另外,來自季節性AR患者的CD4+T細胞,應用芯片分析,結果提示miR-139-3p和miR-223可以發揮互補作用,靶向改變Th2細胞功能,影響Th2細胞因子的釋放[25]。既往對于miR-140的研究發現,在AR患者鼻黏膜中應用qRT-PCR檢測lnc-GAS5、其靶基因miR-21和miR-140及干擾素-γ、IL-2、IL-4 和 IL-10,結果顯示在AR患者中lnc-GAS5升高,而 miR-21和miR-140顯著下調,干擾素-γ和IL-2與lnc-GAS5呈正相,結果提示miR-140與AR的疾病風險、癥狀嚴重程度和Th1/Th2失衡相關[26]。該研究結果與本研究不同,可能為選取檢測組織樣本不同,使得miR-140的表達存在差異,更需要進一步的驗證。

ceRNA網絡中的mRNA是最終發揮效應的主要節點,既往研究發現,血栓素 A2 受體 (thromboxane A2 receptor,TBXA2R)是與慢性氣道炎癥有關的基因。多項研究都提示TBXA2R與呼吸道疾病哮喘間存在密切關系[27-28],且TBXA2R中的rs8113232 SNP位點與哮喘兒童鼻炎之間存在關聯[29]。NOS3缺失導致卵清蛋白致敏小鼠出現中等強度的氣道高反應。除了氣道反應性的差異,在氣道炎癥程度、卵清蛋白特異性IgE水平方面沒有差異[30]。

為了進一步探討AR中差異表達的mRNA生物學功能,我們對ceRNA中46個差異表達mRNA進行了GO和KEGG通路分析,我們發現這些mRNA在“鈣信號通路”和“PI3K/AKT信號通路”中顯著富集,這與之前的觀點一致。免疫細胞中的鈣信號通路參與細胞分化,基因轉錄和效應器功能的調節。細胞內鈣離子水平(Ca2+)的增加是由于免疫感受器的參與,例如T細胞受體,B細胞受體和Fc受體,以及趨化因子和共刺激受體。誘導淋巴細胞中細胞內Ca2+水平增加的主要途徑是通過儲存操作的鈣進入和鈣釋放激活的鈣通道[31]。肥大細胞通過釋放組胺和炎癥因子在AR的過敏性炎癥中起關鍵作用,這一過程稱為脫顆粒[32],蛋白激酶C激活和胞質Ca2+濃度升高的水平這兩種途徑可能共同激活肥大脫顆粒作用,故胞質Ca2+濃度增加對肥大細胞脫顆粒有重要意義[33]。Nian等[34]在研究過敏原激發的NEC與AR中肥大細胞脫顆粒之間的關聯時發現,IL-33及其受體ST2的表達在NEC中升高;同時在肥大細胞中IL-33降低了LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1水平,增加了p62水平,表明LAD2細胞的自噬受到抑制,并驗證了IL-33是通過ST2/PI3K/mTOR介導的自噬來促進AR中肥大細胞的脫顆粒。此外,構建的ceRNA網絡中的mRNA在“ERK1和ERK2級聯”中顯著富集。ERK2/ERK1(也被稱為p42/p44MAPK,正式命名為MAPK1和3),是兩種細胞外信號調節激酶(ERK)的異構體,屬于絲裂原活化蛋白激酶家族成員[35]。Qin等[36]研究發現AR患者血清中IL-36和Th17細胞因子(IL-17和IL-23)的表達顯著上調。而IL-36α可通過介導ERK和PI3K/AKT通路,顯著增加Th17細胞的轉錄因子RORγt的表達,并上調PBMCs對IL-17和IL-23的產生。且IL-17和IL-23可以促進IL-36α的產生,形成一個正反饋回路,從而對AR發揮調控作用。另外有研究稱Ras/Raf/ERK通路可誘導細胞凋亡,其作用機制包括調節Bcl-2蛋白家族控制細胞色素c的釋放及促進caspase-8信號傳導和激活等[37]。因此,我們有理由假設,新構建的ceRNA網絡可能通過調節Ca2+轉運在免疫細胞及細胞因子相互作用在AR中發揮作用。

基于對ceRNA網絡中mRNA生物學功能的分析,結果提示相關機制與自噬及凋亡存在一定聯系,故我們將46個mRNA與PCD相關基因相互取交集,探究特征性PCD在調節AR中發揮的作用。細胞死亡根據可控性分為PCD和非PCD兩大類。炎癥的發生多于PCD相關,但近年來的研究顯示多種細胞死亡也受到程序性控制,多種PCD也與炎癥發生相關。PCD包括凋亡、自噬、壞死性凋亡、焦亡、鐵死亡及細胞衰老等形式[38]。在我們的研究中發現ceRNA網絡中的mRNA主要與凋亡關系密切。凋亡在形態上會出現細胞皺縮、染色質凝集、凋亡小體形成和細胞骨架解離等特征。線粒體凋亡途徑受控于BCL2蛋白家族,死亡受體途徑受死亡受體的介導。而線粒體凋亡在特定條件下對炎癥[39]和天然免疫[40]產生影響。既往研究發現,凋亡與AR相關,包括對中性粒細胞凋亡[41]、嗜酸性粒細胞[42]、嗜堿性粒細胞[43]和鼻上皮細胞凋亡[44]等與AR發生間關系的研究。HCP5與miR-3619-5p相互作用以調節胃癌(gastric cancer,GC)細胞的凋亡[45]。新構建的ceRNA網絡中的mRNA,如巨噬細胞凋亡抑制劑又稱 CD5L,主要由巨噬細胞分泌,其可在炎癥反應和免疫抑制相關病理過程中重要發揮作用[46],故我們推測HCP5可能通過ceRNA機制調節細胞凋亡從而對AR產生影響。最后,我們將新構建的ceRNA中的mRNA進行靶器官定位網路分析,顯示mRNA主要在神經免疫系統為主的相關組織器官中表達,提示與神經、免疫等功能有關。

本研究通過RNA測序確定了來自AR組及對照組中差異表達的lncRNA、miRNA和mRNA數據,并構建了ceRNA網絡,初步探索出HCP5介導的ceRNA網絡可能通過影響細胞凋亡對AR發揮作用。研究仍存在一些局限性,首先選取的樣本量較少,可能會影響結果的質量,且暫未對測序結果進行相關表達量及功能驗證,進一步研究應擴大樣本量并進行相關試驗驗證。其次,研究選取外周血成分相對復雜,結合既往研究,未來可針對相關免疫細胞進行篩選和驗證。這些實驗可能有助于了解AR的病理機制,幫助尋找AR治療的潛在藥物靶點。