239例外耳道真菌病的真菌菌種分布及藥敏檢測結果分析

彭丹,毛承剛,孫毅,孔夢丹,沈敏

(長江大學附屬荊州醫院 荊州市中心醫院 1.耳鼻咽喉頭頸外科;2.皮膚科,湖北 荊州 434020)

外耳道真菌病,也稱為真菌性外耳道炎,是真菌病原體侵襲淺表皮膚的感染性疾病,主要累及外耳道,占所有外耳道炎的9%～27%[1],當患者伴有鼓膜穿孔或合并其他基礎性疾病時也可引起中耳腔的感染[2]。外耳道真菌病在熱帶及濕熱地區發病率較高,常見誘發因素有氣候(濕熱環境)、外耳道炎、皮膚真菌病、耳部水接觸史、外耳機械性損傷及機體免疫力低下或局部使用類固醇制劑等。臨床表現為耳癢、耳痛、耳漏、耳脹滿感、聽力障礙和耳鳴等[3]。雖然外耳道真菌病很少危及患者生命,但由于其高復發率和對抗真菌藥耐藥,因此對于臨床工作也是一個極大的挑戰。識別真菌病原體和易感因素對于治療此類疾病的成功和預防復發很重要[4]。本研究針對收集的本地區診斷為外耳道真菌病患者的外耳道分泌物或碎片,進行真菌形態學檢測、真菌培養、DNA提取和ITS區PCR擴增DNA測序對菌種進行鑒定,行最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)試驗判斷常用抗真菌藥物的耐藥性,以指導臨床用藥。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本實驗收集2020年4月—2021年11月就診于荊州市中心醫院確診為外耳道真菌病的239例患者的外耳道分泌物或碎屑,經外耳道真菌分離最終檢測證實主要為曲霉菌屬和念珠菌屬。本實驗已通過荊州市中心醫院倫理委員會批準并獲得所有患者的知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 真菌鏡檢及真菌培養 將分離的外耳道真菌標本取樣至于載玻片上,熒光染液染色(江蘇萊芙時代生物科技公司,Ⅰ型/200T)后熒光顯微鏡(廣州明美MF23)觀察真菌菌絲及芽生孢子。將另一部分標本通過無菌棉簽涂布于添加了含0.05 mg/mL的氨芐青霉素(ampicillin,AMP)的沙氏葡萄糖固體培養基(sand glucose solid medium,SDA),置于35℃溫箱中培養3～5 d,觀察菌落性狀,初步判斷真菌菌種。

1.2.2 分子鑒定 取培養好的分離物利用真菌提取試劑盒(Omega D3390-02 Fungal DNA Kit真菌DNA小量提取試劑盒)提取真菌DNA,通過使用引物ITS1(5-tccgtaggtgaacctgcgg-3)和ITS4(5-tccgtaggtgaacctgcgg-3)對分離的基因進行聚合酶鏈式反應(PCR),擴增分離物的ITS區。將擴增好的產物進行瓊脂糖凝膠電泳。利用紫外線分析儀對電泳后的瓊脂糖凝膠進行分析,將有條帶的產物送往生工生物工程有限公司(武漢分公司)進行序列測定,鑒定分離株。獲得的序列結果與genbank已知數據(blast; https://blast.ncbi.nlm.Nih.gov/blast.cgi)進行比對,確定真菌菌種。

1.2.3 體外藥物敏感性試驗 所有的曲霉分離株依據美國臨床實驗室標準委員會提出的M38-A3文件[5]中所述的微量肉湯稀釋法進行測試。本實驗選用4種臨床上常用的抗真菌藥物:聯苯芐唑(bibenbenzazole,PCB)、克霉唑(clotrimazole,CLO)、特比奈芬(terbinafine,TRB)和伊曲康唑(itraconazole,ITR)進行體外藥物敏感性試驗。

將4種藥物使用分析純二甲基亞砜溶解成濃度為6 400 mg/L的藥液。4種藥物均購買自美國selleck公司。隨后按照M38-A3文件[5],利用標準RIMP1640液體培養基,配置4種藥物的單藥96孔藥敏板。其中PCB、CLO配置成抗菌劑濃度為0.125～16 μg/mL,8個濃度梯度藥敏板[5];TRB、ITR配置成抗菌劑濃度為0.062 5～8 μg/mL,8個濃度梯度藥敏板[5]。每個藥敏板設置1組空白對照。

將培養好的外耳道真菌分離菌株,在無菌生理鹽水中稀釋,通過血細胞計數板對稀釋過的菌液中的分生孢子進行定量測定。隨后在RPMI1460液體培養基中將懸浮液最終接種濃度調整為(0.4～5)× CFU/mL。向配置好的4種藥物的藥敏板中加入定量的菌液,放置于35 ℃恒溫培養箱中培養46～50 h。MIC判斷方法參照M38-A3文件[5],即在視覺上確定為抑制可識別生長的藥物的最低濃度(100% 抑制)。每種分離菌株進行兩次相同的藥物敏感性實驗,以減少實驗誤差。C.parapsilosis ATCC 22019作為質量控制和參考菌株,用以保證藥敏板質量[5]。

1.3 數據分析

所有獲得的實驗數據通過IBM SPSS 21.0軟件進行數據分析。使用描述性統計(平均值、標準差、中位數)分析臨床和人口統計數據。所獲得耐藥株數量占真菌數量的百分比為耐藥率。

2 結果

2.1 外耳道真菌病患者臨床特點

確診為外耳道真菌病的患者在耳內鏡下可見真菌碎片或附著有白色或黑色、棉狀或油脂狀碎屑分泌物。239例患者中,男140例,女99例;年齡0.3～79歲,平均年齡(39.72±13.33)歲,其中30～39歲占比最多(26.78%),其次為40～49歲(24.67%),只有1例(0.42%)<10歲;大部分病程<3個月(82.43%),平均病程1.46個月。見圖1、2。

圖1 不同年齡段外耳道真菌病患者菌種分布圖

2.2 真菌培養及鑒定

分離的外耳道真菌菌株通過熒光染色后在熒光顯微鏡下可觀察到大量真菌菌絲及芽生孢子。外耳道分離真菌在SDA上培養3～5 d后可觀察呈現不同表觀。具體結果見圖3、4。

239例患者的分離菌株中222例為曲霉菌,其中有138例經培養測序確定為土曲霉(57.74%),其次為黃曲霉(20.50%)、黑曲霉(10.88%)。17例經培養測序確定為念珠菌(7.11%)。具體結果見表1。

表1 外耳道真菌病患者分離真菌菌種分布 (株,%)

2.3 藥物敏感性實驗

表2、3列出了239例(株)分離菌株中222例(株)曲霉菌屬對4種抗真菌藥物的藥物敏感性實驗結果以及各抗真菌藥物對實驗菌株總的耐藥率結果。在222例實驗菌株中,外耳道真菌病致病菌株對PCB和CLO耐藥(MIC>16 μg/mL)率高,分別為31.08%和31.53%。分別有1株實驗菌株對TRB和ITR表現為耐藥(MIC>8 μg/mL),耐藥率為0.45%(表2)。

表2 222例實驗菌株中4種抗真菌藥物總耐藥率 (株,%)

在239株分離株中,黃曲霉對PCB耐藥率最高,高達85.71%,除樣本量<10例的煙曲霉和花斑曲霉外,黃曲霉對CLO耐藥率(36.75%)最高。僅有1例土曲霉表現為對TRB耐藥(>8 μg/mL),耐藥率0.72%,無黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉及花斑曲霉表現為對TRB耐藥。僅有1例黑曲霉表現為對ITR耐藥(>8 μg/mL),耐藥率3.85%,無土曲霉、黃曲霉、煙曲霉及花斑曲霉表現為對ITR耐藥。具體數據見表3。

表3 分離菌株對4種抗真菌藥物MIC及耐藥率 (株,%)

3 討論

外耳道真菌病屬于耳鼻咽喉科的常見疾病,是一種侵襲外耳道皮膚的淺部真菌感染,極易復發[6]。本課題統計僅發現1例小于10歲的兒童患者,可能與本次收集的時間段有關,且所有年齡段均有受累。大于80%的患者發病年齡為30～ 60歲,這與之前的發現相似[1,7]。在有完整臨床資料的180例患者中僅2例伴糖尿病,其余患者均無明顯基礎疾病,表明外耳道真菌病常累及免疫功能正常的患者。本研究中所涉及到的2例糖尿病患者均表現為復發,推測帶有基礎疾病的患者復發率要高于免疫功能正常的患者,其他研究有類似結果報道[8-9]。在既往的研究中,女性外耳道真菌病的發病率高于男性[8],這與本研究的結果不同。

有學者研究發現,在我國北方地區外耳道真菌病常見的致病菌種依次為黑曲霉、土曲霉、黃曲霉和煙曲霉[10];我國西部地區最常見的致病菌種則為土曲霉、煙曲霉、黑曲霉和黃曲霉[11];我國南方地區最常見的致病菌則為黑曲霉、土曲霉、黃曲霉以及少量念珠菌[12]。國外的學者研究表明,伊朗地區常見的致病菌依次為黑曲霉、白色念珠菌以及煙曲霉[13];西班牙常見致病菌則為煙曲霉、土曲霉、黃曲霉以及黑曲霉[14]。本實驗鑒定出本地區常見致病菌依次為土曲霉、黃曲霉、黑曲霉、煙曲霉以及念珠菌。不同地區主要致病菌略有差異,考慮與不同地區地理環境、氣候條件以及風土習俗相關。

抗真菌藥物體外藥物敏感性試驗表明曲霉對PCB和CLO均呈現較高的耐藥率,尤其是黃曲霉。在本地區常見致病菌中,黃曲霉對PCB和CLO的耐藥率均為最高的。我們考慮與黃曲霉在自然界中分布最為普遍、接觸抗真菌藥物可能性最高有關。實驗中所涉及的曲霉對TRB和ITR耐藥率極低,239例中,只有1例對兩種藥物表現為耐藥。這與其他研究結果相似[10-13]。

在本課題中我們發現外耳道真菌病患者常合并鼓膜穿孔。有文獻報道[15],大多數穿孔位于錘骨柄附近,其原因考慮是毗鄰血管中真菌性血栓形成,導致鼓膜缺血性壞死。另有研究表明[8],外耳道真菌病患者中鼓膜穿孔發生率約為10%,并不屬于罕見的并發癥?？紤]可能和以下原因相關:外耳道真菌病繼發鼓膜穿孔的發現主要基于臨床診療,由于外耳道真菌病患者外耳道有大量分泌物及碎屑,需要在耳內鏡下清除干凈后才能完全窺清鼓膜;其次,并發的鼓膜穿孔通常很小,難以檢測;最后,通常認為鼓膜穿孔與外傷和化膿性中耳炎相關性較大,而外耳道真菌病并發鼓膜穿孔患者的表現又與化膿性中耳炎類似[16]。根據以上原因,需要我們在臨床診療過程中更多關注,否則容易出現誤診。

外耳道分泌物或碎屑真菌培養陽性是診斷外耳道真菌病的金標準[10-13]。確定真菌菌種以及進行體外藥物敏感性試驗,針對性選用抗真菌藥物是治療外耳道真菌病、防止抗真菌藥物濫用和防止耐藥菌產生最好的辦法。但由于培養時間長、檢測手段匱乏,以上方案在臨床中應用比較困難。臨床目前對于外耳道真菌病的診斷和治療主要依靠臨床醫生的經驗。因此有相關研究提出[17],利用多重PCR技術,不需行外耳道分泌物、碎屑培養而直接對相關標本進行分子測序,判斷菌種,可以準確快速診斷外耳道真菌病。其次,有報道提出[18],利用計算機深度學習軟件在分析和學習大量耳內鏡圖片的前提下可以對外耳道相關疾病進行較為高準確率和客觀的診斷。因此不同地區進行外耳道真菌病致病菌種檢測以及體外藥物敏感性試驗,對于當地外耳道真菌病的診療、抗真菌藥物的選擇具有較強的指導意義。

綜上所述,準確診斷外耳道真菌病,選用合適的抗真菌藥物,對于外耳道真菌病的治療至關重要。在本地區,外耳道真菌病最常見的致病菌種為土曲霉,其次為黃曲霉、黑曲霉等。致病菌株對PCB和CLO耐藥率高,對TRB、ITR耐藥率極低。因此,在臨床診療過程中,可首選含有TRB及ITR類的藥物。