神經退行性疾病相關蛋白病理性聚集和液液相分離研究進展

唐一鳴，姚逸飛，楊中元，周運，王子超，韋廣紅

（復旦大學物理學系，表面物理國家重點實驗室，計算物質科學教育部重點實驗室，上海 200438）

蛋白質是生物功能的主要執行者，它們通過折疊成特定的空間結構來發揮生理功能，但在一定的條件下會發生錯誤折疊和聚集并導致疾病。神經退行性疾病就是一類以蛋白質異常相互作用和聚集為病理特征的疾病，如阿爾茨海默病與β淀粉樣蛋白（amyloid-β， Aβ）形成的淀粉樣斑塊以及微管相關蛋白（tubulin associated unit， Tau）異常聚集而形成的神經纖維纏結有關［1］；帕金森病的病理特征是α-突觸核蛋白（α-synuclein，αSyn）聚集成的路易小體［2］；肌萎縮側索硬化癥與TDP-43蛋白包涵體有關［3］。除此之外，最新研究表明：很多神經退行性疾病相關蛋白（包括Tau［4］、αSyn［5］、TDP-43［6］）亦能發生液液相分離并組裝成液態凝聚物（在體內被稱為無膜細胞器），進而發揮調控信號傳導和異染色質轉錄等生理功能［7］。病理性纖維化與液液相分離是蛋白質聚集的兩種形式，蛋白質液液相分離可能是下一步錯誤聚集和纖維化的驅動力［8-9］。在細胞微環境（如pH、溫度）改變或氨基酸突變等情況下，蛋白質液態凝聚物會進一步發生液-固相變，形成病理性纖維［10］。表1列出了部分能發生纖維化和/或相分離的神經退行性疾病相關蛋白。

表1 代表性神經退行性疾病相關蛋白的聚集和相分離能力Table 1 Aggregation and phase separation of proteins associated with neurodegenerative diseases

研究蛋白質分子間相互作用以及聚集的微觀機理，對于進一步理解蛋白質的生理功能和病理過程，以及相關疾病的藥物研發具有非常重要的科學意義和應用價值。目前對于神經退行性疾病相關蛋白的毒性機理和纖維化機制已經有廣泛和深入的研究。利用X射線衍射、核磁共振、冷凍電鏡等實驗方法，研究人員解析出了大量蛋白的纖維結構，它們具有cross-β的結構特征，即由主鏈間氫鍵穩定的β折疊結構。多種實驗方法已經被用來表征蛋白質的纖維形貌和纖維化過程［28］；計算模擬被用來研究纖維的熱力學性質、揭示蛋白-蛋白以及纖維-抑制劑之間的相互作用機理［29-30］。與此相比，蛋白質液液相分離微觀機制的研究尚處于起步階段。目前普遍認為蛋白質固有無序區域之間的多價相互作用是相分離的主要驅動力［31-32］，但對于凝聚物內部的蛋白構象特征、蛋白-蛋白、蛋白-RNA之間的相互作用模式等，尚知之甚少。本文將以神經退行性疾病相關蛋白為切入點，綜述它們病理性聚集和液液相分離的前沿進展，介紹表征蛋白質聚集體形貌和空間結構的實驗手段，研究蛋白質相互作用、聚集和相分離微觀機理的理論和計算方法，以及預測相分離能力的機器學習方法。

1 神經退行性疾病相關蛋白病理性聚集的實驗研究方法

為了理解神經退行性疾病的病理過程，揭示相關蛋白病理性聚集的物理機制，國內外實驗工作者已經開展了大量研究，包括解析纖維的空間結構和形貌、表征纖維化的動力學過程等。表2列出了主要實驗方法（主要包括譜學方法和顯微方法兩大類）以及它們各自的適用范圍。

表2 研究蛋白質病理性聚集的主要實驗方法Table 2 Major experimental methods for studying protein pathological aggregation

圓二色譜法（circular dichroism spectroscopy，即CD譜）［33］和傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy， FTIR）［34］等譜學方法常用來測定蛋白質鏈中的二級結構含量。這些方法具有操作簡便、測定時間短等優點，但不能表征二級結構在蛋白質鏈上的分布。根據核磁共振方法（nuclear magnetic resonance， NMR）測得的特定原子化學位移，可以得到每個氨基酸形成的二級結構類型［46］。跟蹤熒光強度的時間演化是實驗表征蛋白質纖維化過程以及抑制劑分子干預的主要手段，如ThT熒光光譜法（ThT fluorescence spectroscopy， ThT-FS）［35］。例如根據在Tau255-411溶液中加入硫酸化的肝素后的ThT信號的增長速度快慢，判定肝素對Tau蛋白片段的纖維化的影響［47］。值得注意的是，一些外源性化合物本身會導致ThT熒光信號產生偏差［48］。

掃描電鏡（scanning electron microscope， SEM）［36］、透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）［37］、原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）［38］等方法是用于表征淀粉樣纖維空間形貌的常用方法。如Islam等［49］結合TEM和SEM觀測到Aβ淀粉樣纖維具有螺旋狀纏結的形貌；Makky等［50］通過TEM發現Tau蛋白能形成6種具有不同形貌的纖維，并通過AFM給出了這6種纖維的高度。由于淀粉樣纖維不溶于水，又很難結晶，常規的解析蛋白質結構的方法，如晶體X射線衍射和液體核磁共振不能用于解析纖維的結構。X射線衍射只能得到主鏈的骨架信息，即cross-β結構。例如Salveson等［51］通過X射線衍射（X-ray diffraction， XRD）方法解析出了具有cross-β結構的Aβ16-36纖維。解析纖維原子分辨空間結構的主要方法包括固體核磁共振（solid-state NMR，ssNMR）［40-41］和冷凍電鏡［43］方法。如Tuttle等［52］通過ssNMR解析出了全長Aβ40的纖維結構。Gremer等［53］、Fitzpatrick等［13］以及Li等［21］分別通過冷凍電鏡解析出了全長Aβ42蛋白、Tau306-378和TDP-43低復雜度結構域（low-complexity domain， LCD）的纖維結構。這些纖維結構的解析為藥物研發提供了結構基礎。

用于表征蛋白質纖維化過程中蛋白分子內/分子間相互作用的實驗方法有交聯質譜（chemical crosslinking of proteins coupled with mass spectrometry，簡稱CXMS或XL-MS）［44］、核磁共振［40-41］、熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）［45］方法等。例如Daniele Ubbiali等［54］采用交聯質譜的方法跟蹤αSyn蛋白聚集過程中相互作用的演化，觀察到蛋白質鏈隨著聚集進程逐漸伸展；Yoh課題組［55］使用固體核磁共振方法觀察到了αSyn蛋白在纖維化過程中單體構象逐漸伸展并形成β折疊結構的過程。Meng等［56］使用單分子熒光共振能量轉移方法研究了Aβ40和Aβ42的單體構象，發現兩者單體結構均呈現高度無序的狀態。上述這些實驗手段為揭示蛋白質聚集機理提供了重要幫助。

2 神經退行性疾病相關蛋白自聚集和共聚集的實驗研究

神經退行性疾病通常伴隨著神經系統中的不溶性淀粉樣蛋白斑塊，這些斑塊通常由一種或多種蛋白質聚集而成［57］。研究相關蛋白質的聚集和共聚集，對深入理解神經退行性疾病的復雜病理學成因至關重要。本節以αSyn、TDP-43、Aβ、Tau、FUS等疾病相關蛋白為例，簡要介紹實驗上對它們形成的纖維結構的表征，并以αSyn和Aβ蛋白為例，介紹它們與其他蛋白質共聚集的研究工作。上述五個蛋白中，αSyn、Aβ和Tau蛋白是固有無序蛋白，而TDP-43和FUS蛋白則分別包含了長為148、165個氨基酸的固有無序區域，它們均具有高親水性、高帶電性和結構無序的特征。圖1給出了Aβ、αSyn、TDP-43、Tau和FUS代表性的纖維結構及對應的PDB ID。除了PDB ID為2M4J和2LNQ的Aβ纖維結構與PDB ID為5W3N的FUS纖維結構由ssNMR解出，PDB ID為5XSG的FUS纖維結構由X射線衍射解出外，圖中其余結構均由冷凍電鏡解出。該圖的最左邊給出了每種蛋白或其LCD的氨基酸占比（“其他”包含了所有低于5%含量的氨基酸）。

圖1 神經退行性疾病相關的五種蛋白的氨基酸組成和代表性纖維結構Fig.1 Amino acid composition and fibril structures of neurodegenerative disease-related proteins

2.1 阿爾茲海默病與Aβ、Tau蛋白

阿爾茨海默病是全球第一大神經退行性疾病，它的病理進程與大腦中β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）和微管相關蛋白（Tau）形成的神經纖維纏結有關。Aβ是最早被關注和研究的淀粉樣蛋白之一，全長的Aβ共有42個氨基酸，存在多個氨基酸數目少于42的異構體，其中Aβ40和Aβ42是兩種被廣泛研究的重要異構體。在過去的二十多年里，研究人員已經通過核磁共振、冷凍電鏡等方法解析出了全長Aβ及其多個片段的空間結構，如2M4J［58］、5OQV［53］等。Tau蛋白是一種主要在腦細胞中表達的微管相關蛋白，由441個氨基酸組成，主要具有穩定軸突微管的生理功能，其微管結合域由4個重復單元組成（R1～R4）。早在1963年和1981年，研究人員就找到了2種不同形貌的Tau蛋白的纖維——雙螺旋細絲形態（PHF）和直絲形態（SF）［59-60］，但直到2017年這2種纖維結構才被冷凍電鏡解出（PDB ID：5O3T，5O3L）［13］。從不同的神經退行性疾病患者大腦中提取的Tau蛋白纖維空間結構不同，如從皮質基底節變性患者大腦內提取的兩種纖維結構（PDB ID：6TJO、6TJX）［61］，不同于從眼頸肌張力障礙病人體內提取的兩種纖維結構（PDB ID：7P66、7P67）［62］。這些結構的解析為進一步理解蛋白質錯誤折疊/纖維化與不同神經退行性疾病的關系提供了新的視角，并為這些疾病的藥物研發提供了新的線索。

2.2 帕金森病與α-突觸核蛋白

帕金森病是全球第二大神經退行性疾病，其病理特征是大腦中主要由αSyn蛋白聚集成的淀粉樣斑塊（路易小體）［63］。αSyn共有140個氨基酸，由N端結構域、纖維核心域（NAC）和C端結構域組成。目前已有多個全長αSyn或其片段的纖維結構被解析出來，其中2016年Tuttle等采用固體核磁共振（ssNMR）方法解析出的全長纖維，2018年采用冷凍電鏡方法，Li、Stahlberg和Ye三個課題組分別解析出了αSyn片段的纖維結構。這4個結構均具有希臘鑰匙（Greek-key）的結構特征，即單體由多段β折疊在空間蛇形排列，它們的PDB ID分別是2N0A［52］、6A6B［64］、6H6B［65］、6CU7［66］。2019年Guerrero-Ferreira等［19］解出了兩個單體結構類似但原纖維間界面不同的αSyn片段纖維結構；2020年Schweighauser等［20］解析了2種從病人體內提取的αSyn片段纖維結構。而這4個結構沒有Greek-key的結構特征。除此之外，氨基酸突變、翻譯后修飾等會影響αSyn的分子內/間相互作用模式，從而使纖維結構不同于野生型纖維。例如H50Q、G51D、A53T這三個突變均會改變原纖維間的界面，從而改變纖維形貌（PDB ID：6PES［67］、7E0F［68］、6LRQ［69］）。N端截短（如Δ1-40）和磷酸化（如pY39）等翻譯后修飾都會改變纖維的空間結構（PDB ID：7LC9［70］、6L1U［71］）。

2.3 肌萎縮側索硬化癥與TDP-43蛋白、FUS蛋白

肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）也稱漸凍人癥，其病理特征是大腦組織中由多種蛋白聚集形成的不溶性蛋白質包涵體，TDP-43和FUS蛋白是其主要成分。TDP-43蛋白由414個氨基酸組成，包括3個結構域：N端結構域、RNA識別結構域和C端低復雜度結構域（LCD）。其中LCD結構域對TDP-43的聚集具有至關重要的作用，且其單獨也能夠發生纖維化。近年來LCD區域多個片段的纖維結構被解出，2019年Cao等［72］通過冷凍電鏡解出了5個長度不同的LCD短肽片段纖維結構，其形貌各不相同（PDB ID：6N37、6N3B、5O3L、5O3T、6GX5）。Guenther等［73］找出了LCD區域中6個能獨立形成空間拉鏈結構的片段（PDB ID：5WKD、6CEW、6CB9、5WIQ、5WIA、5WHN）。全長LCD纖維結構于2021年被Li等［21］通過冷凍電鏡方法首次解析出來，該纖維（PDB ID：7KWZ）包含一個由139個殘基堆疊而成的纖維核。LCD包含了TDP-43蛋白約90%的病理性突變，大部分突變能夠加速纖維化過程或改變纖維形貌。例如野生型LCD312-317片段能夠形成動態可逆的纖維，但A315E/T突變會導致固態不可逆纖維的形成［73］；A315T突變會使LCD286-331片段在體外形成的纖維神經毒性增強［74］；G335D突變能促進LCD發生從螺旋到β折疊的結構轉變從而促進其聚集［75］。LCD片段及全長LCD纖維結構的成功解析，為進一步理解TDP-43蛋白質的異常聚集和纖維化奠定了基礎。

FUS蛋白由526個氨基酸組成，它在生物體內參與轉錄調節、RNA代謝和DNA損傷修復等多種生理功能［76］。FUS蛋白包含兩個結構域：位于N端的低復雜結構域（LCD）和位于C端的RNA結合域，其中LCD對FUS蛋白的聚集具有至關重要的作用。2017年Murray等［22］在大腸桿菌中表達，并進一步得到了FUS全長LCD（氨基酸1～214）的纖維，并通過ssNMR方法解出了其核心片段（FUS37-97）的纖維空間結構；2018年Luo等［77］采用X射線衍射方法解出了FUS37-42與FUS54-59片段的纖維結構（PDB ID：5XSG、5XRR）。這些研究發現FUS形成的纖維具有熱可逆性（升高溫度纖維溶解，降低溫度纖維重新形成）。2020年Lee等［78］采用冷凍電鏡方法得到了FUS112-150片段的纖維結構（PDB ID：6XFM），其形貌具有U型的特征。最近Sun等［79］采用冷凍電鏡方法，解析出了LCD區域34-124片段的纖維結構（PDB ID：7VQQ），該纖維片段由具有V型、S型和N型特征的3個區域組合而成。

TDP-43 LCD片段和FUS LCD片段以及全長TDP-43 LCD纖維結構的成功解析，為進一步理解TDP-43、FUS蛋白質的異常聚集和纖維化以及肌萎縮側索硬化癥等疾病的分子機制奠定了基礎。

2.4 多種神經退行性疾病相關蛋白的異質相互作用

研究表明，兩種不同神經退行性疾病相關蛋白的錯誤折疊和聚集存在關聯。例如，①αSyn和Tau蛋白存在強病理性關聯：在患有路易小體癡呆的病人中，編碼αSyn和Tau蛋白的基因（SNCA和MAPT）具有強相關性［80］；②錯誤折疊的αSyn和Tau蛋白均具有細胞間傳遞的能力［81］；③在患有阿爾茲海默病、ALS等多種神經退行性疾病的患者腦組織中αSyn和Tau蛋白存在共定位［82-83］。研究人員已經通過體外實驗深入研究了αSyn和Tau的相互作用模式：如將αSyn加入到Tau蛋白液態凝聚物中時，αSyn帶負電的C端能與Tau帶正電的聚脯氨酸結構域P2（198-243殘基）結合，加速凝聚物向固態纖維轉變（圖2）［84］。Aβ的N端可以與αSyn的N/C端結構域相互作用形成異質二聚體［85］。另外，阿爾茨海默病和Prion疾病也存在病理關聯［86］，病理學研究表明Prion蛋白能與阿爾茨海默病患者腦組織中的Aβ淀粉樣蛋白發生免疫共沉淀現象［87］。淀粉樣纖維的多形性，以及多種蛋白質異質相互作用的實驗發現，為神經退行性疾病的機理研究和藥物開發帶來了新的挑戰。

圖2 神經退行性疾病相關的四種蛋白的單體、淀粉樣纖維和共聚集形成的異質凝聚體［84-87］Fig.2 Monomer conformations, amyloid fibrils of proteins related to neurodegenerative diseases and their heterogeneous aggregates[84-87]

3 神經退行性疾病相關蛋白構象分布、相互作用和病理性聚集微觀機理的模擬研究

雖然實驗研究在纖維結構解析方面取得了重大進展，但通常只能得到纖維的靜態結構，再加上蛋白質低聚體構象高度動態變化及其不穩定性，因此實驗方法很難識別纖維的最小穩定單元、揭示抑制劑分子與纖維相互作用的微觀機理，以及表征聚集早期蛋白質的構象變化和低聚體結構特征。隨著蛋白質力場的發展與完善，分子動力學等計算機模擬方法能夠在原子/分子水平研究蛋白質/多肽的聚集過程［88］?；诜肿觿恿W模擬的軌跡，一方面，計算二級結構含量和分布可以與實驗給出的CD譜、化學位移結果對比，而計算氨基酸間距離能與FRET實驗結果等對比，驗證模擬結果的可靠性；另一方面，可以實現對纖維熱力學和動力學性質、蛋白質相互作用以及聚集機理的表征。分子動力學模擬的流程見圖3。

圖3 通過計算模擬研究蛋白質相互作用及病理性聚集的流程圖Fig.3 Flow sheet for studying protein interactions and pathological aggregation by computational simulation

3.1 纖維最小穩定單元的確定和纖維-抑制劑相互作用的計算模擬

以纖維結構為初始構型作分子動力學模擬可以用來確定纖維最小穩定單元，表征纖維熱力學和動力學性質、纖維內部分子間/內相互作用以及纖維與溶劑之間相互作用。如針對Aβ42的L-S型纖維結構，全原子分子動力學模擬發現四聚體是其最小穩定單元［89］；而對于TDP-43288-319片段的纖維結構，模擬表明七聚體是其最小穩定單元［90］。針對同種蛋白不同纖維結構的模擬，可以比較它們各自的穩定性，給出穩定它們空間構型的重要物理相互作用類型。例如，Natesh等［91］針對三種Aβ纖維結構（PDB ID：2M4J、2LMN、2LMP）進行了分子動力學模擬，發現這三種纖維具有不同的穩定性，并揭示了穩定各自纖維結構的分子間相互作用。另外，針對抑制劑（如小分子、抗體等）抑制纖維化或破壞纖維結構的實驗發現，研究人員開展了一系列模擬工作，旨在揭示相應的抑制和破壞機理，為進一步篩選或設計新型藥物分子提供理論指導。比如利用常規或增強采樣的分子動力學模擬，研究了不同分子對Aβ原纖維的破壞機制，發現：桑黃素破壞鹽橋和氫鍵［92］；辣椒提取物wgx-50通過疏水相互作用［93］、aducanumab抗體通過特異性結合纖維N端［94］來破壞纖維；手性小分子（+）-Catechin和（-）-Catechin構象差異引起空間位阻效應的不同，呈現出對Aβ原纖維不同的破壞效果［95］。最近本文作者所在的課題組采用分子動力學模擬研究了黃芩素對多種不同形貌αSyn纖維的破壞，發現黃芩素對不同纖維具有不同的破壞效果和機理［96］。這些模擬結果為相關疾病藥物的篩選和設計提供理論指導。

3.2 蛋白質寡聚體構象分布的模擬研究

模擬蛋白質分子的自發聚集過程和低聚體構象分布，是理解蛋白質聚集微觀機理的有效手段。限于模擬時間尺度和計算資源，很難從全原子水平直接模擬大量蛋白分子自發組裝成纖維的過程，目前研究主要側重于聚集早期低聚體的構象分布和蛋白間相互作用模式。

以Aβ及其短肽為例，國內外多個課題組分別采用副本交換分子動力學研究了Aβ40和Aβ42的二聚體構象分布，發現二聚體構象結構多樣，既包含無序結構，也包含多種富含β片層的構象，并給出了穩定二聚體的相互作用類型［97-98］。除了構象熱力學特性，Cao等［99］將分子動力學模擬與馬爾可夫態模型結合，研究了Aβ蛋白二聚化的動力學過程。與Aβ相比，αSyn、Tau等蛋白的氨基酸序列較長，現有工作大都針對它們的重要片段進行研究。例如，Yamauchi等［100］通過增強采樣方法給出了NAC核心短肽片段68GAVVTGVTAVA78二聚體的構象分布；Yoon等［101］采用常規分子動力學模擬揭示了短肽71VTGVTAVAQKTV82四聚體的自發組裝過程。微管結合域是Tau蛋白纖維化的關鍵區域。Ganguly等［102］通過副本交換方法揭示了位于微管結合域的R2和R3片段形成的同源和異源二聚體的分子間相互作用模式和構象分布。最近，我們針對R3片段二聚體和肝素的混合物開展了副本交換分子動力學模擬，結果表明肝素能增強PHF6片段（306VQIVYK311）之間疏水、芳香堆積相互作用，從而促進R3的自聚集［103］。

3.3 機器學習方法結合分子動力學模擬實現對蛋白構象的高效采樣

近年來，隨著蛋白質數據庫的不斷增大，以及計算機算力的提升，機器學習方法也開始被用于研究神經退行性疾病相關蛋白的構象特性。例如周煥祥課題組［104］以聚谷氨酰胺Q15、Aβ40和細胞壁水解酶ChiZ三種天然無序蛋白為研究對象，根據短時間分子動力學模擬得到的構象，利用神經網絡和自編碼器方法生成更加完整的構象空間，其預測結果得到了長時間分子模擬結果的驗證［104］。Jin等［105］結合分子動力學模擬、主成分分析和機器學習方法預測了聚丙氨酸Ala13和鈣調蛋白在原訓練集中不存在的合理構象。這些工作為進一步利用機器學習方法實現蛋白質（尤其是無序蛋白）構象空間高效采樣邁出了重要一步。

4 神經退行性疾病相關蛋白液液相分離的研究進展

蛋白質除了能夠聚集形成固態病理性纖維外，還能發生液液相分離形成液態凝聚物。生物分子的液液相分離是細胞核仁、應激顆粒等多種無膜細胞器形成的主要驅動力，具有重要生物學意義。2009年，Brangwynne等［106］發現重要細胞器P顆粒具有流動、融合、熒光恢復等液態性質。2012年Li等［107］和Kato等［108］分別在體外實驗中觀察到了蛋白質和RNA通過液液相分離形成的小液滴。之后，該領域迎來了爆發式發展，越來越多的蛋白被發現具有相分離能力。此外，蛋白質相分離的生理功能被不斷發現，例如適應性和先天性免疫信號傳導、應激顆粒組裝、異染色質形成和轉錄等［109］。除此之外，越來越多的研究表明，神經退行性疾病相關蛋白（如αSyn、TDP-43、Tau等）具有較強的液液相分離能力，且它們的液態凝聚物會在病理條件下發生液固相變，形成有細胞毒性的固態淀粉樣纖維。蛋白質的液液相分離及其與病理性聚集的關系已成為當今物理學和生命科學等交叉領域的研究前沿和熱點。圖4給出了幾種無膜細胞器及幾種典型蛋白形成的小液滴的形貌。

圖4 無膜細胞器與蛋白質通過液液相分離形成的小液滴［4-6，9，106，110-115］Fig.4 Membrane-free organelles and liquid droplets formed by liquid-liquid phase separation of proteins[4-6,9,106,110-115]

4.1 研究蛋白質液液相分離的實驗方法

判斷蛋白質溶液發生相分離的常見實驗方法包括濁度（turbidity）試驗和微分干涉差（differential interference contrast， DIC）顯微鏡。濁度可以用于表征蛋白分子形成凝聚物的能力，而DIC常用于觀察蛋白質相分離形成的小液滴形貌。在這些實驗中，通常需要添加例如聚蔗糖（ficoll）、聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（dextran）等聚合物作為擁擠劑，以模擬細胞中的擁擠環境［116］。濁度和顯微實驗操作簡單，可以實現高通量篩選特定蛋白發生液液相分離的環境條件。例如，劉聰課題組［117］建立了一種高通量篩選蛋白質相分離能力的方法（HiPPS），并系統研究了溶液環境對30多種蛋白質相分離能力的影響。TEM、AFM等方法不僅能用于觀察小液滴形貌，還能在納米尺度精確測量其尺寸。隨著共聚焦顯微（confocal microscopy）和超分辨率成像（super-resolution imaging）技術的不斷發展，可以直接觀察細胞中形成的蛋白質凝聚物的位置和形貌，例如hnRNPA1［118］、C9orf72編碼的二肽重復片段（PR20、GR20）［119］、FUS［115］、Tau［120］、TDP-43［121-122］、αSyn［123］等。值得注意的是，上述方法要求冷凝物中的蛋白質必須先經過抗體染色或熒光標記。

表征蛋白質液態凝聚物的物化性質（包括黏度、表面張力、流動性、密度、蛋白質的二級結構等），對理解蛋白質液液相分離的物理機制具有重要意義。在體外實驗中，確定聚集體物態性質的最直接的途徑是測量小液滴的黏度和表面張力［124］。光成像的技術可以用來表征凝聚物流動性的強弱，例如光漂白熒光損失實驗（fluorescence loss in photobleaching， FLIP）、光漂白熒光恢復實驗（fluorescence recovering after photobleaching，FRAP）、熒光關聯光譜（fluorescence correlation spectroscopy， FCS）等［10］。其中最常用的是FRAP實驗［125］，它已經被廣泛應用于區分蛋白質聚集形成的液態和固態聚集體，以及表征小液滴的成熟（即由液態向固態轉變）過程［109，126］。FRET方法常用來表征蛋白質發生相分離過程中的構象變化；ThT熒光和CD譜用來研究蛋白質在發生相分離過程中二級結構的變化。此外，拉曼光譜［127-128］也被用于表征蛋白質在發生相分離前后的構象轉變。

4.2 神經退行性疾病相關蛋白液液相分離的實驗研究

多種神經退行性疾病相關蛋白既能發生病理性聚集形成固態淀粉樣纖維，也能發生液液相分離形成液態凝聚物。例如αSyn、TDP-43和Tau蛋白均同時具有纖維化和相分離能力。生理條件下αSyn蛋白以富含螺旋的單體形式與神經囊泡結合，參與囊泡形狀調節、神經遞質釋放、化學信號傳遞等生理功能；在病理情況下它會發生異常聚集，形成具有毒性的寡聚體或纖維。2020年Ray等［5］首次在體外實驗中觀察到了αSyn形成的小液滴，并發現液滴流動性隨時間逐漸降低，最終轉變成固態聚集體。同年，Hardenberg等［123］在細胞實驗和試管實驗中分別觀察到了αSyn的液態凝聚物及其進一步轉變成的凝膠狀聚集體。上述結果表明αSyn不僅能發生液液相分離，且其相分離與聚集密切相關。進一步研究表明，pH值、鹽濃度、擁擠劑等微環境［129］，乙?；?29］和截短［130］等翻譯后修飾，黃酮類小分子［131］等均能調控αSyn的相分離。

2015年Molliex等［9］通過添加類泛素蛋白修飾分子標記（SUMO）降低蛋白質溶解度的方法，首次觀察到了全長TDP-43蛋白的相分離。2016年，Conicella等［6］觀察到了TDP-43 LCD區域的相分離，并發現位于321～340區域的6個ALS突變對LCD相分離能力具有破壞作用。黃介嶸課題組［132］利用NMR和光學顯微技術研究了G298S等三個ALS相關突變體的相分離能力，提出疏水相互作用驅動LCD的相分離。吝易等［133］的研究表明該區域只在酸性條件下才有較高的螺旋傾向性，而在中性或堿性條件（pH>6.5）下螺旋傾向性降低，β傾向性升高［133］。最近，McKnight課題組［134］將位于316～339的螺旋區域、能形成側鏈氫鍵的氨基酸分別突變成甘氨酸，系統研究了23種突變對TDP-43 LCD相分離能力的影響，發現只有P320G突變能夠完全抑制LCD的相分離。除突變外，翻譯后修飾也能調控TDP-43的相分離，如C端磷酸化能增加TDP-43小液滴的流動性、抑制其纖維化［135］。

2017年Ambadipudi等［15］首次在試管實驗中觀察到Tau蛋白微管結合域的液態凝聚物，并發現磷酸化能增強其相分離能力；2018年，Wegmann等［8］首次觀察到了帶GFP標記的全長Tau蛋白形成的小液滴，該液滴隨時間失去流動性，轉變為固態聚集體。2020年，Zhang等［136］在體外細胞實驗中觀察到了全長Tau蛋白的液態凝聚物。除此之外，研究人員還通過多種實驗手段研究了Tau蛋白相分離的微觀機制。Ambadipudi等［137］通過NMR實驗找到了對Tau微管結合域K18相分離重要的3個六肽片段和4個KXGS片段。Boyko等［138］通過研究多個Tau蛋白截短體的相分離能力，提出Tau蛋白的相分離主要由N端負電荷與C端正電荷之間的靜電吸引所驅使；Majumdar等［139］測量了K18溶液在相分離不同階段的熒光光譜，發現K18單體在凝聚相中比在溶液中具有更伸展的構型，由此提出，單體構象的轉變以及單體-水相互作用的增強是K18相分離的驅動力之一。氨基酸突變能影響Tau的相分離：K274Q突變能顯著降低Tau蛋白相分離的臨界濃度［140］；雖然疾病相關突變體P301L、G272V、ΔK280對Tau的相分離能力沒有顯著影響，卻能加速液-固相變［141］。

2015年Patel等［142］通過體外重組實驗發現，全長FUS蛋白能夠通過液液相分離形成小液滴，且這些液滴隨時間會發生液固相變形成固態聚集體。Kang等［143］通過DIC方法發現LCD區域單獨也可以發生相分離，對FUS相分離的發生具有驅動作用。Avni等［128］采用一種基于拉曼散射光譜的高靈敏單液滴振動方法，表征了FUS蛋白液滴內部的分子間相互作用，并提出陽離子-π與π-π相互作用對FUS的液液相分離起到重要作用。磷酸化、甲基化等翻譯后修飾可以調控FUS的相分離，其效果與翻譯后修飾位點有關。例如FUS LCD區域中四個絲氨酸（Ser26、Ser42、Ser61和Ser84）各自的磷酸化均能抑制LCD的液液相分離［144］；位于纖維核心片段（37~97）上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化能顯著抑制液滴的形成［22］；而Y526氨基酸的磷酸化卻能促進FUS在細胞質內的相分離［145］。體外試驗發現精氨酸的甲基化修飾可以抑制FUS的液液相分離［115］。此外，鹽離子和RNA也可以調節FUS LCD的相分離能力［146］。

一種蛋白的液液相分離會受到另一種蛋白或RNA的調控。例如αSyn能分別與TDP-43、Tau蛋白發生相互作用從而調節后者的相行為：αSyn能促使TDP-43 LCD與RNA共同形成的小液滴發生液固相轉變，且形成的纖維相較于TDP-43單獨形成的纖維具有更強的病理毒性［147］；αSyn也能夠調控Tau凝聚物的液固相變［148］。顆粒體蛋白（granulin）也能調控TDP-43 LCD的相分離，其效果依賴于顆粒體蛋白的種類［149］。Lin等［150］發現RNA能促進hnRNPA1、FUS等固有無序蛋白的液液相分離。Maharana等［151］發現RNA在低和高濃度下分別能促進和抑制TDP-43/FUS蛋白的相分離。進一步的研究還表明RNA與TDP-43的特異性結合能抑制TDP-43凝聚體的液-固相變［121，152］。

4.3 研究蛋白質液液相分離的理論和計算研究

隨著蛋白質相分離的實驗報道不斷涌現，國內外多個課題組開始用理論和計算手段闡釋其背后的物理機制，但該領域仍處于起步階段。由于相分離現象涉及大量蛋白分子，體系巨大，目前大都采用連續場近似或高度簡化的粗?；Ｐ?，這些方法能定性給出相圖，幫助理解相分離的熱力學特性，但缺乏對凝聚物內部分子結構細節、物理相互作用的精確描述。僅有少量工作嘗試采用全原子分子模擬，從單體構象分布的角度來研究相分離的微觀機制。

4.3.1 基于平均場的理論和計算研究

Flory-Huggins理論是高分子物理中研究聚合物相分離的理論模型之一。Overbeek和Voorn［153］在該理論的基礎上引入靜電項，實現對帶電聚合物相圖的計算。該方法被用于蛋白質相分離的研究，首次給出了Ddx4蛋白N端區域的相圖，并提出驅使其相分離的主要相互作用是靜電作用［154］。Chan課題組［155］在上述平均場理論的基礎上引入隨機項近似，發現電荷分布模式能影響蛋白的相分離能力［圖5（a）］。結合平均場理論描述的體系能量函數和體系密度分布的時間演化方程進行模擬采樣（即場理論模擬），可以獲得蛋白體系的相圖［圖5（b）］［156-157］。

圖5 研究蛋白質液液相分離的相關計算模擬方法［155，157，159，171，175-176］Fig.5 Computational methods for studying protein liquid-liquid phase separation[155,157,159,171,175-176]

4.3.2 粗?；肿幽M研究

粗?；Ｐ统１挥脕碇苯幽M蛋白的相行為。目前最常用的是Mittal課題組［158-159］開發的基于長條形模擬盒子的方法——slab模擬（slab simulation）［圖5（c）］。該方法將蛋白質簡化為由彈簧勢相連的粗粒小球鏈，每個小球代表一個氨基酸，采用氨基酸疏水性指數（hydrophobic-scale， HPS）［160］或Kim-Hummer勢函數［161］來描述小球間的范德華相互作用，采用Debye-Hückel勢函數來描述靜電相互作用。slab模擬主要優點是可以方便地計算高、低密度相的密度。Mittal課題組用這一方法研究了多種蛋白的相分離，例如FUS蛋白LCD域［162］、TDP-43蛋白LCD區域及多個突變體［163］、LAF-1蛋白RGG結構域［164］等，并系統研究了35種無序蛋白相分離能力的溫度依賴性，區分了具有上/下臨界溶解溫度（UCST/LCST）相分離行為的蛋白，發現它們具有不同的氨基酸組成特征［158］。之后，多個課題組采用slab模擬方法，或對其勢函數及參數作修正，研究了LAF-1、Ddx4、hnRNA1等蛋白的相分離行為［165-169］。也有課題組借用此粗?；鞍踪|模型，在立方盒子中模擬蛋白質的相分離［170］，但由于計算兩相密度存在困難，通常無法給出相圖。另一種研究蛋白質液液相分離并計算相圖的方法是周煥祥課題組［171］開發的基于Gibbs系綜的模擬方法［圖5（d）］。該方法采用蒙特卡洛方法同時模擬處于兩個獨立盒子（具有不同初始密度）中的蛋白質，在模擬過程中允許盒子間粒子交換，直到達到穩定共存的兩相，他們用該方法研究了RNA調控蛋白質液液相分離的微觀機理［171］，區分了三種對蛋白質相分離具有不同影響的調控因子（regulator）［172］。

上述模擬方法雖然能研究蛋白質的兩相共存狀態，并給出相圖，但其模型過于簡化，無法精確描述對相分離重要的物理相互作用（比如π堆積相互作用等），以及溶劑對相行為的影響?；趯蝹€氨基酸簡化為多個小球的粗?；鞍啄Ｐ秃惋@式溶劑模型相結合的方法，Hummer課題組［173］采用修正的Martini 2.2力場研究了FUS蛋白LCD區域的相分離，計算得到了凝聚相的表面張力和剪切黏度［173］；Marrink課題組［174］采用Martini 3.0力場模擬了鏈長為30的聚賴氨酸和聚谷氨酰胺的相分離，并給出了鹽離子和RNA對它們相分離能力的影響。本課題組基于Martini 2.2力場，開發了一套能精準計算兩相密度、表征蛋白質聚集體流動性的計算方法，并系統研究了所有400種二肽的聚集和相分離能力，給出它們的液液相分離傾向性評分（LLPS score），其中對4種典型二肽（QW、GF、WW、VI）相分離能力的預測得到了實驗驗證，此外，模擬還給出了QW液液相分離的相圖［圖5（e）］［175］。

4.3.3 全原子分子模擬研究

雖然粗?；M已被廣泛應用于研究蛋白質和短肽的相分離能力和相行為，但不能描述對相分離過程具有重要作用的蛋白構象特征。全原子模型可以精確表征蛋白的構象分布、二級結構特性，預測對相分離重要的物理相互作用。本課題組［176］通過對Tau蛋白K18單體進行全原子副本交換分子動力學模擬，發現K18單體的構象特征和物理特性（例如單體塌縮度、二級結構含量和相互作用強度）具有非線性的溫度依賴關系，與其相分離行為的溫度依賴性一致，表明該蛋白質的液液相分離能力編碼在其單體構象中，從而為用全原子模型研究蛋白質的相分離行為提供了一種新的思路和方法。通過計算蛋白質不同區域二級結構含量的溫度依賴關系，從K18中找出了對液液相分離和纖維化重要的六肽片段，并得到實驗驗證［圖5（f）］。Zheng等［177］通過將粗?；肿幽M得到的蛋白質高密度相還原成全原子模型，表征了液滴中氫鍵、鹽橋等物理相互作用。

4.3.4 蛋白質液液相分離數據庫和機器學習預測方法

目前已有多個蛋白質相分離相關的數據庫被構建，例如，DrLLPS儲存了在真核細胞內與相分離有關的43萬多個蛋白質，并將它們分為scaffold、regulator、client三類［178］；LLPSDB［179］和PhaSepDB［180］儲存了文獻中報道的具有相分離能力的蛋白質序列及相分離實驗條件等信息；MloDisDB儲存了無膜細胞器及與它們相關的疾?。?81］。Chu等［182］基于LLPSDB給出蛋白質信息，測試了采用支持向量機（SVM）、決策樹（DT）、K近鄰（KNN）、梯度提升決策樹（GBDT）等機器學習方法，以及詞向量（w2v）等蛋白質序列編碼方法，根據蛋白質序列預測其相分離能力，發現采用GBDT和w2v方法預測準確度最高，并用這兩種方法開發了PSPredictor預測工具。van Mierlo等［183］提出一種相分離分析和預測機器學習分類器PSAP，成功預測了DAZAP1、CPEB3等新的具有相分離能力的蛋白。這些數據庫和相分離能力預測工具，為預測新型蛋白質的相分離能力提供了一種簡易方便的手段。

5 總結與展望

本文簡要介紹了表征蛋白質聚集過程、聚集體形貌、相分離能力的實驗和模擬方法，以及多種典型的神經退行性疾病相關蛋白聚集和相分離的研究進展，并簡述了機器學習方法在蛋白質構象空間和相分離能力預測方面的應用。蛋白質的可逆液液相分離具有重要生理功能，而不可逆的液固相轉變卻能導致疾病，蛋白質液液相分離和液固相變微觀機制的闡釋對深入理解神經退行性疾病的致病機理具有重要理論意義，同時也是開發具有潛在治療效果的新型藥物的前提和分子基礎。盡管目前已經有大量蛋白質聚集和液液相分離的實驗研究，但相關的模擬研究工作還相對較少，人們對蛋白質共聚集和液液相分離的微觀機理、液液相分離與病理性聚集關聯的理解還非常有限。表征凝聚體內部蛋白質的構象特征及其關鍵物理相互作用、液固相變的動力學和熱力學特征，對計算模擬和實驗都是一個很大的挑戰。實驗手段和模擬方法相結合來深入、全面地揭示蛋白質相分離和聚集背后的分子機制，是該領域未來重要的研究方向。微觀機制的闡釋對深入理解神經退行性疾病的致病機理、開發具有潛在治療效果的新型藥物有重要理論意義和應用價值。