39份外引小麥種質的抗葉銹病基因檢測及其抗性鑒定

董 娜,王玉泉,陳向東,胡鐵柱,吳曉軍,張亞娟,茹振鋼

(河南科技學院小麥中心/河南省雜交小麥重點實驗室/現代生物育種河南省協同創新中心,河南新鄉453003)

小麥葉銹病是由專性寄生真菌小麥葉銹病菌(Pucciniatriticina)引起的一種真菌性氣傳病害,在世界各小麥生產國均有發生,分布比條銹病、稈銹病更廣。在中國,小麥葉銹病是影響小麥生產的重要病害之一,短期內可造成大面積流行,嚴重時可導致小麥減產5%～15%,甚至絕收[1]。近年來,由于氣候變暖、播種密度大等因素的影響,各麥區葉銹病有加重發生的趨勢。

發掘和利用抗病基因是控制小麥葉銹病最經濟、有效且安全的方法。迄今為止,國際上已發現100多個小麥抗葉銹病基因[2-7],在除5A和6D以外的其他染色體上都有分布。由于小麥抗葉銹病基因小種?；詮?抗病基因容易隨葉銹病菌毒力頻率的變化或新毒力小種的出現而喪失功能,目前Lr1、Lr3、Lr10、Lr11、Lr16、Lr26等基因單獨存在時已基本喪失抗性[8-10]。因此,廣泛開展種質資源抗性評價以及抗病基因鑒定,對小麥抗葉銹病育種具有重要意義[11]。

國外種質資源的引進和合理利用是豐富我國小麥品種抗病遺傳多樣性、促進小麥生產發展的有效途徑之一[12]。近年來,伍 玲等[13]利用分子標記對CIMMYT 273個小麥品種的抗病基因Lr34/Yr18/Pm38進行檢測,篩選出含有該位點的材料43份,在不同地點對條銹病、葉銹病和白粉病具有不同程度的抗性;鄭慧敏等[14]通過對70份國外小麥品種(系)進行苗期和成株期抗葉銹病鑒定,鑒定出15個抗葉銹病基因,篩選出慢銹性材料39份;焦 悅等[15]從50個國外小麥品種(系)中檢測到7個抗葉銹病基因,篩選出慢銹性材料19份;王思曼等[16]在69份國外小麥品種(系)中檢測到6個抗葉銹病基因,篩選出慢銹性材料46份。這些研究表明,國外小麥品種中含有豐富的抗葉銹病基因,可作為我國小麥抗葉銹病育種的抗病資源加以利用。

本研究利用已開發的與抗葉銹病基因(Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26、Lr34、Lr37和Lr38)緊密連鎖或共分離的分子標記,對本課題組保存的39份國外小麥種質進行抗葉銹病基因檢測,篩選出葉銹病抗性表現突出的材料,以期為小麥抗病材料的合理利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試39份小麥種質材料(表2)由河南科技學院小麥中心收集和保存,分別引自智利、墨西哥、澳大利亞、俄羅斯等10個國家。葉銹病菌為小麥生產上流行小種PHT和THT混合菌株,購自中國農業科學院植物保護研究所。

1.2 方法

1.2.1 田間接種及葉銹病抗性鑒定

供試小麥種質材料秋播于河南科技學院百泉校區試驗基地的種質圃中,種質圃行長4 m,每份材料種植兩行,常規田間管理,于第二年春季小麥返青后取幼嫩葉片,用于基因組DNA提取。于拔節期采用注射法接種葉銹病菌孢子懸液,每行接種1個分蘗,于灌漿中期調查葉銹病病害等級,調查兩次,間隔7 d,按0～4級法進行病級劃分[17]。劃分標準:0級(免疫型),葉上無可見癥狀;0;級(近免疫型),葉上產生小枯斑,無孢子堆;1級(高抗型),夏孢子堆小,周圍有枯斑;2級(中抗型),夏孢子堆小到中等,生在綠色組織上,周圍有枯斑;3級(中感型),夏孢子堆較大,周圍組織有褪綠現象;4級(高感型),夏孢子堆大,周圍不褪綠。葉銹病抗性鑒定于2018-2021連續三年進行,取發病最重的等級作為最終抗性結果。

1.2.2 小麥抗葉銹病基因分子標記檢測

小麥葉片用液氮研磨后,采用CTAB法提取基因組DNA,通過紫外分光光度計和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA質量檢測,DNA原液稀釋至50 ng·μL-1,備用。利用與抗葉銹病基因連鎖的分子標記在S1000型梯度PCR儀(Bio-Rad,美國)上進行抗病基因分子檢測。PCR反應體系為10 μL,包括模板DNA 50 ng,2×Taq Master Mix(康為世紀,北京)5 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,ddH2O補足至10 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性50 s,45～65 ℃退火50 s,72 ℃延伸45 s至2 min(退火溫度和延伸時間參照文獻進行),38個循環;72 ℃終延伸10 min,4 ℃保存。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠(含goldview),在110 V下電泳40 min,利用凝膠成像儀(Bio-Rad,美國)進行觀察并拍照保存。所用引物序列見表1,由上海英濰捷基貿易有限公司合成。

表1 本研究所用的標記引物

2 結果與分析

2.1 抗葉銹病基因的分子標記檢測結果

利用與小麥抗葉銹病基因Lr1共分離的STS標記引物WR003F和WR003R對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料能擴增出753 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,KPL-1、OK.95571、野貓等12份材料能擴增出該條帶,說明這些材料攜帶Lr1,頻率為30.77%(表2)。

M1:DL2000 DNA marker;M2:100 bp DNA ladder;Lr26-1:利用標記ω-secalinF和ω-secalinR的檢測結果; Lr26-2:利用標記O11B5和O11B3的檢測結果;1:澳阿優1號; 2:KPL-1;3:KPL-3;4:阿大學AGT-②;5:鳥麥;6:攀道拉;7:智矮早;8:硬質博萊特;9:CL0401;10:CL0407(早);11:CL0419;12:CL0438;13:CL0442;14:墨特大;15:MRYC;16:墨176;17:墨S139;18:CMT-3(T88);19:薩爾斯堡;20:意大利白麥;21:Ciava;22:法國材料;23:bermude;24:魯昂-10。箭頭所指為目標條帶。

表2 外引小麥種質攜帶的抗葉銹病基因及其抗病性

利用與小麥抗葉銹病基因Lr10共分離的STS標記引物Fl.2245和Lr10-6/r2對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料能擴增出310 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,KPL-1、野貓、TAMOI等7份材料能擴增出該條帶,說明這些材料攜帶Lr10,頻率為17.95%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr20共分離的STS標記引物STS638-L和STS638-R對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料能擴增出542 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,僅薩爾斯堡能擴增出該條帶,說明該材料攜帶Lr20,頻率為2.56%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr24共分離的SCAR標記引物S1302-609F和S1302-609R對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料能擴增出607 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,KPL-3和OK.95571兩份材料能擴增出該條帶,說明這兩份材料攜帶Lr24,頻率為5.13%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr26共分離的STS標記引物ω-secalinF和ω-secalinR以及O11B5和O11B3對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料利用ω-secalinF和ω-secalinR能擴增出1 067 bp的特異條帶,不含該基因的材料利用O11B5和O11B3能擴增出636 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,HUAYUN、 智矮早、MRYC等5份材料能擴增出1 067 bp的條帶,而不能擴增出636 bp的條帶,說明這5份材料攜帶Lr26,頻率為12.82%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr34緊密連鎖的STS標記引物csLv34F和csLv34R(遺傳距離為0.4 cM)對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料能擴增出150 bp的特異條帶,不含該基因的材料能擴增出229 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,澳阿優1號、OK.95571、Jaggar-1等12份材料能擴增出150 bp的條帶,說明這12份材料攜帶Lr34,頻率為30.77%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr37共分離的STS標記引物VENTRIUP和LN2對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料能擴增出259 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,澳阿優1號、KPL-1、KPL-3等9份材料能擴增出該條帶,說明這9份材料攜帶Lr37,頻率為23.08%(表2)。

利用與小麥抗葉銹病基因Lr38共分離的SCAR標記引物Y38SCAR982F和Y38SCAR982R對其進行分子標記檢測,發現含有該基因的材料能擴增出982 bp的特異條帶(圖1)。在39份種質材料中,KPL-3和OK.95571兩份材料能擴增出該條帶,說明這2份材料攜帶Lr38,頻率為5.13%(表2)。

2.2 抗葉銹病基因的分布及種質抗性評價

從表2可知,29份材料至少攜帶1個所檢測的抗葉銹病基因。聚合兩個抗葉銹病基因的材料13份,其中攜帶Lr1+Lr10、Lr1+Lr26、Lr10+Lr37、Lr34+Lr37的材料各1份;攜帶Lr26+Lr34的材料2份;攜帶Lr1+Lr37的材料3份;攜帶Lr10+Lr34的材料4份。聚合3個抗葉銹病基因的材料2份,為KPL-1和KPL-3,分別攜帶Lr1+Lr10+Lr37和Lr24+Lr37+Lr38。OK.95571攜帶的抗葉銹病基因最多,有5個,分別為Lr1、Lr24、Lr34、Lr37和Lr38。葉銹病抗性鑒定結果表明,39份種質材料中,表現為近免疫和中抗的材料分別為4份和8份,頻率分別為10.26%和20.51%,其余27份材料均表現為中感或高感,頻率為69.23%。聚合兩個抗葉銹病基因的種質材料中,攜帶Lr1+Lr10和Lr10+Lr37的材料對葉銹病表現為高感,攜帶Lr1+Lr26和Lr1+Lr37的材料表現為中感,攜帶Lr34+Lr37和Lr26+Lr34的材料表現為中抗,而攜帶Lr10+Lr34的材料抗性表現不一致,其中兩份表現為中抗,兩份表現為中感。聚合3個抗葉銹病基因的種質材料中,攜帶Lr1+Lr10+Lr37的材料(KPL-1)對葉銹病表現為近免疫,攜帶Lr24+Lr37+Lr38的材料(KPL-3)表現為中抗。聚合5個抗葉銹病基因的材料(OK.95571)對葉銹病表現為近免疫。

進一步分析發現,Lr1、Lr20、Lr37單獨存在時,種質材料基本喪失抗性,雖然攜帶Lr1的兩份材料(莫斯科39和非黑土地24)抗性很好,達到0;級,但是從攜帶Lr1種質材料的總體抗性來看,這兩份材料的葉銹病抗性應該是由其他未檢測到的抗葉銹病基因引起。本研究未檢測到僅攜帶Lr10、Lr24或Lr38的材料,Lr24和Lr38與其他抗葉銹病基因聚合時,種質材料表現為中抗或近免疫;Lr10與Lr1或Lr37聚合時,種質材 料表現為高感,與Lr34聚合時,種質材 料表現為中感或中抗。另外,聚合3個及3個以上抗葉銹病基因的材料對葉銹病均表現為中抗或近免疫,說明聚合多個抗葉銹病基因有利于提高小麥種質材料的葉銹病抗性。

3 討論

基于PCR的分子標記技術為種質資源中抗病基因的準確鑒定提供了有效工具,利用與抗病基因緊密連鎖或共分離的分子標記對目標基因進行分子檢測,不受組織器官類型和生長發育時期的限制,操作簡便快速,而且可有效鑒定種質材料中抗病基因的組成。本研究所用的與抗葉銹病基因Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26、Lr34、Lr37和Lr38緊密連鎖或共分離的分子標記,在輔助抗病育種和種質資源鑒定中已有廣泛應用,具有良好的特異性和穩定性[14-16],通過對39份外引小麥種質進行抗葉銹病基因檢測和田間接種鑒定,對種質材料的葉銹病抗性進行了評價。

Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26和Lr38為全生育期抗葉銹病基因。Lr24和Lr38分別來源于小麥近緣物種長穗偃麥草和中間偃麥草,對我國葉銹菌生理小種具有很強的抗性。陳萬權等[9]研究表明,中國小麥葉銹菌群體對Lr24和Lr38的無毒基因頻率達100%。王 志等[27]對小麥抗葉銹病材料的Lr24、Lr38基因進行分子標記檢測和抗性鑒定,結果表明,單獨含Lr24或Lr38以及二者聚合的材料對葉銹病抗性均表現為免疫或近免疫。姚宏鵬等[28]對小麥抗葉銹病基因聚合材料的抗性鑒定也有類似的結果。本研究中含有Lr24和Lr38的兩份種質分別表現中抗和近免疫,與前人結果基本一致。Lr26來源于小麥-黑麥1BL/1RS易位系,陳萬權等[29]、袁軍海等[10]、鄭慧敏等[14]的研究結果均表明,Lr26單獨應用時,材料已喪失抗性。本研究中,MRYC、墨176只檢測到Lr26基因,對葉銹病分別表現為中感和中抗,推測墨176的抗性可能由其他未檢測的抗葉銹病基因引起。

來源于普通小麥的Lr34以及來源于偏凸山羊草的Lr37為成株期抗性基因。陳萬權等[9]研究表明,Lr34成株期侵染型表現為中感,但終期病害比率小于10%,具有明顯的慢葉銹病特征;Lr37成株期侵染型表現為中感及以上水平,終期病害比率在65%以上。本研究發現,Lr34和Lr37單獨存在時,材料對葉銹病分別表現為中感和高感,但兩者聚合時表現為中抗,說明Lr34和Lr37聚合時能提高載體種質的抗性水平。這與Kloppers等[30]的研究結果一致。

本研究檢測到聚合3個及3個以上抗葉銹病基因的種質,即KPL-1(Lr1+Lr10+Lr37),KPL-3(Lr24+Lr37+Lr38)和OK.95571(Lr1+Lr24+Lr34+Lr37+Lr38),其對葉銹菌均表現為中抗或近免疫,說明聚合較多的抗葉銹病基因有利于提高葉銹病抗性,抗病基因聚合是開展小麥抗病育種的有效途徑,同時這些種質也為抗葉銹病育種提供了重要抗源。另外,莫斯科39和非黑土地24兩份材料對葉銹病抗性均表現為0;級,但分子標記檢測結果顯示,這兩份材料僅攜帶Lr1,說明這兩份材料可能含有其他抗葉銹病基因,有待對其進行深入分析。