ssRNA病毒侵染宿主細胞與細胞抗病毒作用的研究進展

謝春芳 于瑞嵩 董世娟 陳冰清 李春華

摘 ?要：單鏈RNA（single-strand RNA，ssRNA）病毒是感染人和動物的主要病原體之一，部分ssRNA病毒感染宿主后會對宿主產生致命的影響，也有部分ssRNA病毒進入宿主后不會引發明顯的病變和臨床癥狀。ssRNA病毒與宿主細胞之間的感染與抗病毒所產生的炎癥反應、細胞凋亡、細胞溶酶體/自噬應答均是動物機體在ssRNA病毒入侵后產生的一系列抗病毒活動。大量研究解析了ssRNA病毒與宿主細胞之間的相互關系，但仍有許多未知領域阻礙著抗ssRNA病毒研究的前進步伐?；谝压_發表的研究論文，筆者梳理并分析了ssRNA病毒與被侵染細胞之間的相互關系，為后續研究ssRNA病毒與宿主細胞應答反應提供理論支持。

關鍵詞：ssRNA病毒；宿主細胞；抗病毒炎癥反應；凋亡和自噬應答

中圖分類號：S852 文獻標志碼：A ? ? ? 文章編號：1001-0769（2023）03-0078-07

感染人和哺乳動物細胞的RNA病毒主要是單鏈RNA（single stranded RNA，ssRNA）病毒。ssRNA病毒可引起神經系統、免疫系統、心血管系統、消化系統、呼吸系統和生殖系統的各種損傷，從而產生各種癥狀，如出血熱、心肌炎、肺炎、免疫缺陷和生殖系統疾病、腹瀉和代謝紊亂，威脅人和動物的健康，增加病毒的傳播[1-8]。

ssRNA病毒主要有正義單鏈RNA（positive-sense single-strand RNA，+ssRNA）病毒、反義單鏈RNA（negative-sense single-strand RNA， -ssRNA）病毒和反轉錄（retrovirus）病毒三種，其中反轉錄病毒是一類具有編碼逆轉錄酶的單鏈RNA病毒。+ssRNA病毒來自冠狀病毒科（Coronaviridae）、黃病毒科（Flaviviridae）、小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）和一些肝炎病毒科的成員[9-11]。如嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2）、黃熱病病毒、登革熱病毒（Dengue virus，DENV）、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、小核糖核酸病毒、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV），戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）[12-17]。-ssRNA病毒主要來自副黏病毒科，如流感病毒[18]。在反轉錄病毒中，研究比較多的是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV），病毒進入細胞核，將RNA反轉錄為cDNA，然后進行復制、轉錄和翻譯[19-20]。

機體的應激反應、炎性反應、天然免疫應答是動物最先產生的對外來入侵病原體的防御屏障，在病毒感染期間，一些熱應激蛋白（heat shock protein，HSP）與免疫相關因子相互作用，可以抑制病毒增殖，并激活免疫應答來保護宿主細胞，發揮抗病毒作用，維持細胞的穩態，或調節炎性相關蛋白的表達，啟動細胞炎性抗病毒反應信號途徑，誘導干擾素的產生，抑制病毒復制；或者調節細胞凋亡相關蛋白的表達，誘導細胞凋亡；同時，一些HSP也會被病毒“劫持”，幫助病毒入侵、復制和成熟，從而增加病毒在宿主細胞內不利條件下存活的機會[21]。

當病毒在宿主細胞內復制增殖的數量不斷增加時，細胞溶酶體/自噬體無法及時清除呈指數級增殖的大量病毒、病毒蛋白及病毒RNA，造成細胞內饑餓應激、壓力應激等細胞穩態失衡，細胞啟動凋亡信號途徑，以終止病毒在細胞內的復制、轉錄、翻譯和增殖等一系列病毒借助于細胞環境及資源而產生的生命活動。

1 ?ssRNA病毒的吸附和入侵

ssRNA病毒通過病毒蛋白與細胞受體結合，使細胞膜融合或通過細胞內吞途徑進入宿主細胞。病毒入侵細胞時細胞膜發生重排，重排后的細胞膜包裹病毒核酸蛋白體進入細胞質中。在冠狀病毒中，病毒的刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S蛋白）是與細胞受體結合的蛋白，對進入宿主細胞至關重要，其N末端S1片段與細胞受體結合，C末端S2片段促進細胞-細胞膜融合。S蛋白S1/S2裂解位點的雙精氨酸基序（RxxR）是膜融合的“開啟”元件，但裂解位點在不同病毒間是不固定的，裂解位點的個數也有差異。如豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）附著在細胞膜上，然后通過鈣黃嘌呤介導的內吞作用（clathrin-mediated endocytosis，CME）或小窩介導的內吞作用（caveolae-mediated endocytosis，CavME）進入細胞漿，形成一個被網格蛋白包裹的小泡，隨后運輸到細胞核附近。在黃病毒中，病毒在低pH環境中與細胞膜融合，同樣以網格蛋白依賴的方式進入細胞質[22-24]。

副黏病毒科的雞新城疫病毒（Newcastle disease viruses，NDV）具有多種入侵細胞的途徑，可以在中性pH環境中與細胞膜受體蛋白結合并發生膜融合，而直接進入細胞質，也可以在低pH的條件下通過內吞途徑進入宿主細胞，但是副黏病毒科和逆轉錄病毒的直接膜融合入侵機制是否這么簡單，有待進一步深入研究[25-26]。

2 ?ssRNA病毒的復制、轉錄和翻譯

+ssRNA病毒進入細胞后，會“劫持”宿主細胞材料和合成機制來編碼其結構蛋白和非結構蛋白，同時合成負義RNA作為產生新病毒的模板[27]。+ssRNA病毒通過RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）反應將一個或多個核苷酸連接到靶蛋白上，使核苷酸?；?。核苷酸的?；瘑硬《綬NA的轉錄和病毒蛋白的翻譯，這個過程中RdRp起著關鍵的作用。RdRp主要參與+ssRNA病毒和-ssRNA病毒基因組的RNA合成和轉錄，RdRp的酶催化需要Mg2+或Mn2+二價陽離子的存在，復制RNA基因組以形成復制模板，從而產生更多的單鏈RNA，成為新合成的病毒粒子的基因組[28]。

-ssRNA病毒如流感病毒進入細胞質后，病毒RNA片段被RdRp結合成RNA蛋白復合物，從細胞質運輸到細胞核，使RNA片段轉錄為信使RNA（messenger RNA，mRNA），并將RNA片段復制為互補RNA（complementary RNA，cRNA），以復制更多的RNA；mRNA從細胞核釋放后，在細胞質中翻譯成病毒蛋白，其中病毒核蛋白被輸入細胞核與RNA片段結合，形成病毒RNA蛋白（viral ribonucleoprotein，vRNP）復合體，vRNP被輸出到細胞質后被病毒的結構蛋白組裝成病毒核心[18]。

與+ssRNA和-ssRNA不同，反轉錄病毒進入細胞后，病毒RNA必須被逆轉錄為雙鏈cDNA，然后進入細胞核，將病毒基因整合到宿主細胞DNA中，以轉錄和復制病毒mRNA和蛋白，在細胞核和細胞質之間穿梭，反轉錄病毒從細胞核輸出未折疊的RNA，輸送到內質網、高爾基體中，進行病毒粒子的蛋白折疊、組裝，一些被泛素化的病毒蛋白具有促進病毒復制的作用[29]。

3 ?ssRNA病毒的釋放

病毒進入宿主細胞，經過復制、轉錄、翻譯后，被包裹到內質網腔中，在病毒感染的過程中，會產生大量RNA聚合酶，并將其集中在滑面內質網產生的液泡（solid membrane vesicle，SMV）膜上[30]。RNA病毒利用內質網作為膜源重排膜，來建立其復制場所，即雙膜囊泡（double-membrane vesicle，DMV），+ssRNA病毒誘導的囊泡類似于具有雙脂質雙層的自噬液泡[31]。囊泡運輸主要依靠微管網絡向細胞外周來回移動[32]，所以推測病毒囊泡也是沿著細胞微管移動。

冠狀病毒通過將內質網吞噬受體蛋白“劫持”并縮合聚集，達到抑制內質網吞噬病毒的作用，從而促進病毒DMV的形成，進而促進病毒復制增加，新生病毒隨后被輸送到高爾基體中，在高爾基體衍生的囊泡中組裝，并激活內質網應激[33-34]；口蹄疫病毒翻譯組裝的新一代病毒，從內質網通過囊泡運輸到高爾基體，最終到達細胞膜[35]。

4 ?細胞促炎性因子和干擾素的表達抑制ssRNA病毒復制

ssRNA病毒與宿主細胞結合后，細胞受到病毒刺激后，HSP表達上升，其中HSP40的家族成員DNAJA3與病毒蛋白（如冠狀病毒的S蛋白）結合，影響病毒對細胞的吸附，抑制病毒的復制[36]；另外HSP70與細胞膜上的Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）相互作用，激活TLR信號途徑，誘導干擾素的產生，起到抑制RNA病毒的作用[37]。TLRs不僅能夠識別外來入侵蛋白，還有識別外來RNA的能力[38]。位于細胞膜上的TLRs有TLR2、TLR4和TLR6；位于細胞質內的TLRs有TLR3、TLR7、TLR8。進入細胞質內的病毒可以激活TLR3、TLR7或視黃酸（也稱“維甲酸”）誘導基因蛋白I樣受體（retinoic acid induces gene protein I-like receptor，RLR）和黑色素瘤分化相關抗原（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5），這些模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）是天然免疫反應信號系統的組成部分，具有檢測各種病原體成分的功能，TLRs檢測到外來病原體和RNA后被激活，促進炎性細胞因子的分泌，如白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、干擾素（interferon，IFN），激發細胞炎癥反應，阻止病毒的吸附侵入，抑制病毒的復制，并把病毒RNA從內質網帶入細胞溶酶體（lysosome）進行降解[39-40]。

環鳥嘌呤腺嘌呤合成酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）是細胞中DNA的識別受體，+ssRNA病毒能夠在不逆轉錄其基因組的情況下激活cGAS-STING途徑，+ssRNA病毒觸發cGAS的機制目前尚不清楚。登革熱病毒非結構蛋白4B（non-structural protein 4B，NS4B）可以使線粒體伸長，這一過程能使線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）釋放到細胞質中，激活cGAS和cGAMP的產生，激活cGAS介導的干擾素基因的刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）和IRF3的核轉位，導致干擾素刺激基因（interferon stimulating gene，ISG）的激活，誘導天然免疫產生的抗病毒反應；HIV同樣能激活cGAS-STING干擾素信號途徑[41，42]。

當細胞引發過度的炎癥反應時，HSP60通過調節RNA病毒識別受體RLR和與外來RNA監測蛋白MDA5相關的RLR/MDA5信號通路，抑制干擾素的表達，抑制炎癥反應[43]。

5 ?細胞溶酶體降解ssRNA病毒途徑

溶酶體是細胞降解外來病原體、錯誤折疊蛋白、細胞代謝物質的細胞器，溶酶體中的酸性pH由液泡型質子轉位ATP酶（vacuolar-type proton-translocating ATPase，V-ATPase）維持，酸性pH是降解蛋白質、脂類和糖類生物分子的關鍵條件。溶酶體也可與細胞內體融合。溶酶體相關膜蛋白（lysosomal associated membrane protein，LAMP）的表達通常與保護溶酶體膜通透性有關[44-45]，對溶酶體的降解起調控作用。

自噬是將細胞廢棄物（細胞器、蛋白質、脂質和糖原）輸送到溶酶體中進行降解的活動，是細胞的保守分解代謝途徑，是一種循環降解系統，以維持細胞穩態保持良好狀態。自噬有小自噬（microautophagy）和大自噬（macroautophagy）之分，溶酶體自身可以吞噬少量的泛素化標記的細胞廢棄物，稱為小自噬；常見的自噬一般是大自噬。大自噬過程可分為內質網形成自噬體捕獲泛素化標記的待降解的蛋白質，然后自噬體與溶酶體外膜融合，自噬體把捕獲物連同內膜轉移到溶酶體中，成為酸性兩棲體即自溶體，自溶體中的內容物包括自噬體內膜，最終都被溶酶體降解[46]。

自噬的發生由未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）引發的內質網應激所控制[45]。大量病毒翻譯后，未折疊的病毒蛋白、病毒RNA聚集在內質網膜上，引起內質網未折疊蛋白反應，被細胞進行泛素化標記，啟動自噬。自噬起始于細胞內質網-線粒體的接觸點，自噬特異性蛋白自噬相關基因14（autophage-related gene 14，ATG14）開始錨定到接觸點上，自噬隔離膜開始形成，隔離膜夾在2個內質網腔中間，其中一個形成狹長的延伸，即Ω形狀的雙膜自噬體，形成自噬體的隔離膜，在吞噬被泛素化的病毒蛋白、RNA等廢棄物時，自噬體形成并伸長[47-49]。

溶酶體、內體、自噬體等具有囊泡的雙膜結構物，囊泡運輸主要依靠微管網絡和相關的運動蛋白，可由細胞外周區向核周區移動，也可由核周區向外周區移動，分別由正向驅動蛋白和反向驅動蛋白驅動囊泡移動[50，51]。

6 ?細胞凋亡對ssRNA病毒生死存亡的影響

細胞的凋亡程序啟動細胞膜上的死亡受體激活；啟動細胞質中線粒體凋亡信號途徑；啟動內質網應激誘導細胞凋亡的發生。在細胞膜上，冠狀病毒的一些結構蛋白和輔助蛋白可以刺激細胞膜上的死亡受體，激活天冬氨酸半胱氨酸特異性蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）的級聯信號途徑，誘導細胞凋亡[52]。

正常情況下，在細胞質中，HSP具有重新折疊被錯誤折疊的蛋白質功能，共同消除不可逆損傷的蛋白質，維持細胞周期、細胞增殖和細胞穩態，使細胞免于凋亡，其中HSP60是一個線粒體蛋白，胞質中的HSP60與促凋亡因子（B-cell lymphoma 2-assiociated x，Bax）形成復合物，抑制Bax向線粒體的移動，起到抑制細胞凋亡的作用[53]；HSP70結合凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）來阻斷細胞凋亡。當細胞面臨病毒對蛋白質等營養物質的競爭，面臨饑餓、缺氧環境、內質網應激狀態時，細胞的內在凋亡信號途徑被激活，啟動細胞凋亡程序，細胞通過自殺式的死亡與病毒“同歸于盡”，維持細胞大環境穩態。在細胞凋亡期間，HSP不僅具有抑制細胞凋亡的作用，同時還有抑制病毒復制的作用[54]。

7 ?討論

ssRNA病毒可以感染的動物物種繁多，引起的疾病類型多種多樣，許多病毒可以跨種傳播。因為RNA病毒的易變特性，造成的傷害程度有嚴重的，有輕微的，盡管差異大，但ssRNA病毒在宿主細胞中的侵染過程和細胞的抗病毒反應還是遵循許多相同的規律。

首先ssRNA病毒基本依賴蛋白與受體結合侵入細胞，細胞感受到病毒侵襲后，積極迅速激活促炎性細胞因子和干擾素的表達，抑制病毒的入侵和復制。假如病毒的毒力低，感染的量少，病毒會在感染初始階段被細胞的天然免疫力屏蔽或抑制，而后被細胞降解系統吞噬降解掉。假如ssRNA病毒沖破細胞的促炎性細胞因子和干擾素的抗病毒防疫屏障，進入細胞內質網或細胞核“劫持”細胞相關蛋白和基因，進行病毒基因的復制、轉錄（反轉錄）和蛋白的翻譯表達，并利用重排內質網膜作為病毒囊泡，成為病毒在細胞中的安全生產場所，屏蔽細胞的自噬體、溶酶體的捕獲、降解系統，同時利用細胞動力蛋白，驅動病毒囊泡運動，從侵染細胞中快速逃逸。細胞在大量病毒蛋白、RNA和cDNA的應激下，啟動溶酶體/自噬體代謝系統，捕獲大量病毒蛋白、RNA或cDNA，進入自溶體降解消化。

大量病毒蛋白、RNA和cDNA在細胞內質網的堆積，使細胞線粒體受到損傷，細胞穩態受到沖擊，細胞各種凋亡因子被激活，啟動凋亡信號途徑進行細胞程序性死亡，達到抑制病毒復制增殖等活動。病毒為了完成子代病毒的復制、轉錄、翻譯、組裝、增殖、傳播所有過程，爭取足夠的時間，抑制細胞的凋亡性死亡。熱休克蛋白在細胞凋亡期間，一方面起保護細胞的作用，抑制細胞凋亡發生，另一方面抑制病毒的復制。細胞與ssRNA病毒之間的存亡，取決于病毒的復制速度、攻擊力及在細胞內的應變能力和細胞的應答反應時間、防御能力，降解病毒能力，是病毒和細胞全方位綜合能力的較量。

到目前為止，許多由ssRNA病毒引發的疾病沒有有效的防治疫苗或藥物，了解病毒侵染細胞的過程，病毒在細胞中的生命周期活動，以及被侵染的宿主細胞所產生的防御、降解的抗病毒應答系列活動，可以為更好地解決由ssRNA病毒引起的疾病，提供理論依據和突破點。

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