旺蒼縣茶樹資源遺傳多樣性分析及分子身份證構建

石保旭　鄭夢霞　向云攀　王波　石嬌嬌　陳九江　唐杰　萬華蘭　張品荔

摘要：旺蒼縣茶樹種質資源豐富，茶種業現代農業園區種質資源圃收集保存了大量本地和國內外代表性茶樹資源。本研究利用SSR分子標記檢測技術對旺蒼縣茶樹資源圃保存的部分資源進行了遺傳多樣性分析，為檢測資源建立了準確的分子身份證；對17份本地古茶樹資源進行了理化成分的全面測定，篩選鑒定出1份低咖啡堿種質。研究結果對旺蒼縣茶樹種質資源鑒定、遺傳多樣性分析和新品種選育具有重要意義。

關鍵詞：茶樹；SSR分子標記；遺傳多樣性；分子身份證

中圖分類號：S571.1；S330? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1000－3150（2023）07-46-8

Genetic Diversity Analysis and Molecular ID

Construction of Tea Resources in Wangcang County

SHI Baoxu1， ZHENG Mengxia2， XIANG Yunpan1*， WANG Bo1*， SHI Jiaojiao2，

CHEN Jiujiang1， TANG Jie3， WAN Hualan1， ZHANG Pinli3

1. Sichuan Wangcang County Tea Industry Technology Research Institute， Wangcang 628200， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Agricultural and Rural Bureau of Wangcang County， Sichuan Province， Wangcang 628200， China

Abstract： Wangcang County is rich of tea germplasm resources. A large number of local and abroad representative tea germplasm resources had been collected and preserved in the tea germplasm resource nursery of modern agricultural park. In this study， SSR molecular marker detection technology was used to analyze the genetic diversity of some tea resources preserved in the resource nursery in Wangcang County， and an accurate molecular identity system was established for the detection of germplasm resources. The physical and chemical components of 17 local ancient tea resources were comprehensively determined， and one low caffeine germplasm was identified. The results are of great significance for the identification， genetic diversity analysis of tea germplasm resources and new cultivar breeding in Wangcang County.

Keywords： tea plant （Camellia sinensis）， SSR molecular marker， genetic diversity， molecular identity card

茶樹是世界上最重要的飲料經濟作物之一，被廣泛種植于全世界超過50個國家和地區。地處四川盆地北緣、米倉山南麓的旺蒼縣，屬亞熱帶濕潤季風氣候，土壤富硒富鋅，適宜茶樹生長。旺蒼縣茶樹種質資源豐富，大兩鎮等地古茶樹分布較為集中且保存完善。2020年建設的茶種業園區，具有茶樹種質資源保護、品種創新、種苗繁育等功能，在木門鎮三合村建成的茶樹資源圃收集保存本地和國內外代表性資源350份。種質資源是開展茶樹種質創新和新品種開發的重要基礎，因此，對旺蒼縣境內茶樹種質資源的遺傳多樣性進行研究具有重要意義。

20世紀80年代以來，DNA分子標記技術早已成為研究植物遺傳多樣性和遺傳演化的有效工具。其中，簡單重復序列標記（Simple sequence repeat，SSR），具有重復性好、多態性豐富、通用性高、操作簡便快速等優點，2005年起就被國際植物新品種保護聯盟（UP-OV）推薦作為建庫優選的標記。Yao等[1]利用96對EST-SSR分子標記研究了來自我國14個茶區的450份資源，發現來自廣西、云南和貴州的茶樹遺傳多樣性最高，距離這些茶樹起源中心越遠，遺傳多樣性逐漸降低。毛娟等[2]發現樣本量在40個時，能夠較好地反映云南白鶯山茶樹資源的遺傳多樣性。羅亦紓等[3]通過21對SSR引物對35份重慶大茶樹種質資源進行研究，結果顯示其中南川1號和南川2號的親緣關系最近。劉冠群等[4]利用SSR分子標記為24份名山良種繁育場具有代表性的茶樹品種構建二維碼身份證。李長樂等[5]利用SSR分子標記對來自12個省份的地方群體品種進行研究，發現供試種質可劃分為四大類型，具有明顯的地域分布規律。

本研究利用15對SSR引物對旺蒼縣茶樹資源圃保存的資源進行PCR擴增，采用熒光標記毛細管電泳檢測擴增產物，建立起保存資源的分子身份證，以期從分子生物學角度對茶樹資源快速準確區分。同時在種質資源豐富的大兩鎮選取了17份茶樹種質資源，進行理化成分（5項常規和兒茶素組成）的測定分析，為利用旺蒼本地資源進行本土化優質品種選育提供數據基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究共采集種植于旺蒼縣茶樹種質資源圃內的160份茶樹資源的葉片組織，樣品采集后液氮迅速冷凍處理，保存在－80 ℃冰箱中備用。另在大兩鎮采集17份茶樹新梢，制成曬青干茶用于內含物檢測。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取

將各份材料分別磨樣，使用艾德萊CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（DN14）提取樣品全基因組DNA，并用l%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用超微量分光光度計檢測其濃度，樣品檢測合格后－20 ℃保存備用。

1.2.2? PCR擴增及產物檢測

15對SSR熒光引物的信息（表1）參考Ma等[6]、譚禮強[7]和徐禮羿等[8]的文獻報道。PCR反應體系為KAPA 2G Robust Mix 7 μL，模板DNA 1 μL，Primer-F、Primer-R（10 mmol/L）各1 μL。PCR反應程序為94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度根據所用引物確定），72 ℃延伸1 min，共計30個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物使用3730 xl DNA分析儀進行毛細管凝膠電泳檢測。

1.2.3? 數據統計分析

運用PowerMarker和PopGene統計每對引物在160個茶樹品種中擴增等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon多樣性指數（I）、Nei's基因多樣性指數（H）、基因型數（Genetype）和多態性信息量（PIC）。運用PowerMarker計算各品種間的Nei's遺傳距離，并基于Nei's遺傳距離進行Neighbor-Joining聚類分析。

1.2.4? 茶樹SSR分子身份證構建

根據每對引物在不同品種上擴增的等位基因數進行賦值，賦值方法參考張小雙[9]的方法：將每對引物在每個材料上擴增出的等位基因從小到大排列，并用阿拉伯數字1～9進行編碼，當基因數大于9時，分別用a、b、c……進行編碼，以此類推，即可得到由26位數字或字母組成的分子身份證。

1.2.5? 理化成分測定

水浸出物含量按照《茶 水浸出物測定》（GB/T 8305—2013）全量法測定；游離氨基酸含量按照《茶 游離氨基酸總量的測定》（GB/T 8314—2013）茚三酮比色法測定；咖啡堿含量按照《茶 咖啡堿的測定》（GB/T 8312—2013）紫外分光光度法測定；茶多酚和兒茶素類含量按照《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》（GB/T 8313—2018）測定。

2? 結果與分析

2.1? SSR引物的多態性

15對SSR引物對160份供試材料的遺傳多樣性分析結果如表2所示。15對SSR引物共擴增出144個等位基因（A），各引物擴增出的等位基因數為4～19個，平均9.6個；Ne為2.51～10.87個，平均5.31個；共檢測到441個基因型，平均每對引物為29個。Ho最大值為0.956 3，最小值為0.562 5，平均值為0.733 8；He最大值為0.910 9，最小值為0.604 0，平均值為0.777 2，Ho小于He，表明在群體內存在非隨機交配現象。I變化范圍較大，為1.050 2～2.547 5，平均1.757 8。H為0.602 1～0.908 0，平均值為0.774 8。各引物擴增的PIC為0.520 3～0.900 8，平均為0.742 4，15對引物均為多態性高（PIC>0.50）的引物，尤其以CsFM1823引物的PIC最高，為0.900 8，擴增得到等位基因18個，基因型個數66個。

2.2? 基于SSR標記的聚類分析

基于15對SSR引物等位基因出現的頻率計算Nei′s遺傳距離（D），并由此對160個供試材料進行Neighbor-Joining聚類分析。聚類結果如圖1所示，160份材料可劃分為3個大的類群，類群間資源數量相當，且類群內部聚類分支多樣。已知龍井黃是龍井43芽變后代，二者聚于同一分支；白雞冠后代、極白茶等來自白化茶樹的資源均聚于同一分支。

2.3? 分子身份證編碼

根據前文提及的等位基因賦值標準，將15對SSR引物對每份茶樹樣品的擴增結果按照從小到大的順序排列，將其轉換為字符進行串聯排列，并用阿拉伯數字和英文小寫字母進行賦值。例如，引物CsFM1068對全部供試材料擴增共獲得19個等位基因，最小為188 bp，最大為257 bp。將全部等位基因從小到大進行排列，即等位基因188 bp賦值為1，以此類推，等位基因257 bp賦值為j。根據以上方法，獲得了每份材料的分子身份證（表3）。

2.4? 旺蒼縣地方茶樹種質資源主要理化成分分析

理化成分檢測結果（表4）表明，旺蒼縣大兩鎮收集的種質資源樣品水浸出物含量為46.6%～53.2%（平均49.5%）；茶多酚含量為16.4%～23.0%（平均18.9%）；游離氨基酸含量為1.8%～3.9%（平均2.7%）；酚氨比為5.1～12.3（平均7.2），其中6個樣品（大兩1、大兩3、大兩8、大兩13、大兩16和大兩19）的酚氨比低于7，具有適制綠茶的物質基礎；咖啡堿含量為0.7%～4.1%（平均2.6%），其中大兩11的咖啡堿含量極低，僅為0.7%，具有選育低咖啡堿品種的潛力；表沒食子兒茶素（EGC）為2.41%～5.67%、DL-兒茶素（DL-C）為0.18%～0.75%、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）為4.83%～10.41%、表兒茶素（EC）為0.68%～1.73%、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）為1.10%～2.63%，兒茶素品質指數為142.79～486.31（平均241.88），兒茶素品質指數愈大，則鮮葉嫩度和品質愈好。

3? 小結與討論

黃丹娟等[10]以13個湖北省優良茶樹品種為供試材料，采用30對SSR熒光引物進行標記，結果顯示平均等位基因數為4.83，平均PIC為0.58；劉冠群等[11]篩選出7個SSR標記對24份名山茶樹進行擴增，發現平均等位基因數為4，平均PIC為0.56；毛娟等[12]利用30對茶樹核心SSR引物在對3個代表性的野生和栽培大理茶居群中檢測到的平均等位基因數為5.9，平均PIC為0.491。本研究所用的15對引物在160份材料中共擴增出144個位點，平均每對引物檢測到9.6個位點，平均PIC為0.742 4，所有引物的PIC>0.5，說明本研究選用的15個SSR標記表現出很高的多態性和雜合性，保證了每份材料都具有獨特的分子身份證。本研究分析獲得的160份茶樹資源基因多樣性范圍在0.602 1～0.908 0，平均值為0.774 8，說明資源圃收集保存的茶樹具有較高的遺傳多樣性。將供試材料聚類分為3個類群，且與供試材料的原產地關系較小，下一步可以利用這些資源進行人工雜交等創制新種質和選育新品種。

分子身份證與指紋圖譜的功能相同，但指紋圖譜存在譜帶較多、人工比對低效和繁瑣等問題，限制了其在大規模品種鑒定中的使用。而分子身份證是將指紋圖譜進行數字化得到字符串形式的結果，可以通過計算機自動比對，特別是條形碼身份證可以被掃碼器快速識別。目前，許多植物已利用SSR標記技術構建分子身份證。張梟等[13]將14對SSR引物獲得的相應等位基因賦值編碼，串聯構建山楂資源的分子身份證；李慧峰等[14]利用SSR熒光標記繪制了41份山東省蘋果資源的分子身份證；苑克俊等[15]構建了4個杏新品系的分子身份證，為利用分子鑒定進行品種權保護提供了依據；武志江等[16]從200對EST-SSR引物中篩選出20對核心引物，成功構建了145份火龍果種質資源的分子身份證。在構建分子身份證時，常采用的編碼方法有3種，本研究選擇將每對引物擴增的等位基因按從小到大排列、依次編碼的方法，從而獲得數字與字母結合的分子身份證，然后再轉化為條形碼，可以快速高效地對茶樹資源進行鑒定。

研究表明，過量攝入咖啡堿會使人體產生焦躁不安、失眠、血壓升高等不良反應。通常，茶葉中咖啡堿含量在3%～5%，若咖啡堿含量低于1%，則屬于低咖啡堿茶樹資源。目前，研究低咖啡堿茶已成為茶葉資源利用、茶葉精深加工及有機食品開發等領域的重要課題。唐一春等[17]從保存在勐海國家茶樹種質分圃的100份茶樹資源中篩選出2份咖啡堿含量分別為0.07%和0.06%的茶樹種質。楊維時等[18]嘗試用茶樹與油茶嫁接選育低咖啡堿茶樹品種。本研究對17份來自旺蒼縣大兩鎮的種質資源進行理化成分測定，發現1份樣品的咖啡堿含量僅為0.7%，有望作為選育低咖啡堿茶樹品種的材料。

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作者簡介：石保旭，男，推廣研究員，主要從事茶園綠色防控、種質資源保護等工作。*通信作者，E-mail：1078062045@qq.com；1403878669@qq.com