粘質沙雷氏菌全能核酸酶的研究進展

趙萍，韓冬梅?

（河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056000）

全能核酸酶又稱非特異性核酸酶 （Nonspecific nuclease，NU），可降解幾乎所有形式的DNA 和RNA （包括單鏈、雙鏈、線狀、環狀、天然以及變性的核酸），生成3～5 個堿基長度的5’-單磷酸寡核苷酸。全能核酸酶來源廣泛，在動物、植物、細菌、真菌和病毒均有發現，到目前為止，已鑒定出30 多種不同來源的全能核酸酶，其中來源于粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）的全能核酸酶活力最強（下文無特殊說明，全能核酸酶均指來源于粘質沙雷氏菌全能核酸酶），能夠在非常廣泛的條件下保持很高的穩定性和消化活力。全能核酸酶在獸醫方面的應用主要是去除獸用疫苗、蛋白、多糖類生物制藥生產過程中的核酸殘留，降解動物性飼料中的病原體的核酸殘留，維護養殖場的生物安全。

1 全能核酸酶結構

粘質沙雷氏菌的全能核酸酶有兩種基因亞型，第一種亞型由245 個氨基酸組成，第二種亞型相對與第一個亞型其N-末端少個三個氨基酸Asp-Thr-Leu，其余氨基酸序列相同。這兩種亞型生化性質幾乎相同，只是在等電點處有微小的差別。全能核酸酶的一級結構、二級結構、三級結構和四級結構均已被證實，率先被解析的是2.1 歐分辨率蛋白晶體結構，隨后1.7 歐分辯率和0.92 歐分辨率蛋白晶體結構依次被解析出來。全能核酸酶不同于其他核酸酶的結構，其精細的結構是由一個包含六個反平行β 鏈的中心層組成，在中心層的兩側有不同長度的螺旋側翼，幾個長的環段將這些區域連接起來。另外，沉降速度實驗、交聯研究、動態光散射實驗以及X 射線晶體數據分析均證實全能核酸酶是由兩條相同的單肽鏈連接在一起的同源二聚體。Ahrenholtz 研究發現粘質沙雷氏菌核酸酶單體的催化中心距離二聚體的接觸位點較遠，二聚體的分離并不影響活性位點與底物的結合。Franke 通過設計正常的核酸酶二聚體、核酸酶單體、以及含有一個突變失活亞基的核酸酶異二聚體三組實驗測定酶活力，結果顯示核酸酶單體、核酸酶異二聚體的活力為正常核酸酶二聚體的一半，從而進一步證明了沙雷菌核酸酶兩個亞基的活性位點具有獨立性。雖然全能核酸酶的二聚化結構不具有協同作用，但增加了酶與底物的碰撞幾率，增強了反應效率。

2 全能核酸酶的表達調控

全能核酸酶的表達調控屬于選擇性表達調控而非常見的底物調控，啟動子上游的操縱基因決定了全能核酸酶的分泌發生在細菌生長的平臺期，胞外核酸酶的分泌量不隨著細胞數量的增加而顯著增加，但在細胞裂解后胞外核酸酶的量會顯著增加。全能核酸酶的激活與位于多肽鏈的N 末端的C9 與C13 和C 末端的C201與C243 之間的兩個二硫鍵的形成有關，二硫鍵的形成發生在細胞周質，因此全能核酸酶分泌到細胞周質或細胞外才具有生物學活性，從而避免了全能核酸酶對自身核酸的降解。

3 全能核酸酶作用機制

3.1 全能核酸酶活性中心功能基團

全能核酸酶催化功能相關的基團是位于活性中心的R57、R87、H89、N119 和E127 殘基，對這些殘基進行突變會導致該酶催化活性的喪失，其中H89 直接參與了磷酸二酯鍵的水解反應，R57和N119 殘基共同起著穩定磷中間體的作用，E127 在整個過程中充當普通堿的作用，R87 作用位點在核糖3' 端的磷酸基上，這對5' 端附近的降解是至關重要的。

3.2 全能核酸酶底物的作用位點

與其他來源的核酸酶比較，全能核酸酶有較高的催化活性，大約是葡萄球菌核酸酶的4倍，是DNase Ⅰ的34 倍。其催化機理與其它核酸酶也略有不同，葡萄球菌核酸酶作用于5’-OH 與磷酸之間形成的磷酸二酯鍵，全能核酸酶和DNase I 作用位點相同，為3’-OH 與磷酸之間的磷酸二酯鍵，但全能核酸酶是從5’端切割磷酸二酯鍵，而DNase I 是從3’端切割磷酸二酯鍵。

3.3 全能核酸酶對底物的偏愛性

雖然全能核酸酶底物譜廣泛，能夠將單鏈、雙鏈、線狀、環狀、天然以及變性的DNA 和RNA降解成3-5 個堿基長度的5’-單磷酸寡核苷酸。但對Poly 結構的核酸降解效率差異很大，對PolyU，PolyG , PolyC，Poly［d(A)］和Poly［d(T)］幾乎不降解，對PolyA 和PolyA·PolyU 可微量降解，對Poly( I)·Poly( C) 可高效降解。另外，全能核酸酶對高GC 含量的堿基序列降解效率高于高AT 含量的堿基序列。

4 重組全能核酸酶的表達

鑒于全能核酸酶在胞內表達會對自身核酸造成降解，從而引起菌體死亡或抑制菌體生長。目前獲得重組全能核酸酶以分泌性表達為主。默克公司最早利用大腸桿菌對重組全能核酸酶進行了分泌性表達，其產量僅達到104單位/升，遠遠不能滿足生產需求。國內學者也陸續對全能核酸酶重組表達進行了研究，張開俊將全能核酸酶基因構建到分泌型載體pET-20b（+）上，在大腸桿菌BL21 進行了分泌表達，其產量為8毫克/升。陳鵬為了解決全能核酸酶胞內本底表達對宿主細胞的傷害，將全能核酸酶與麥芽糖結合蛋白融合基因構建到大腸桿菌表達載體PET22b 上，并在大腸桿菌BL21 中進行了分泌性表達，其產量達到了10 毫克/升。龔雪梅利用短短芽孢桿菌胞外分泌能力，將全能核酸酶基因重組到pNC 載體上，實現了全能核酸酶重組蛋白在短短芽孢桿菌胞外分泌表達，其產量達到30～40 毫克/升。田克恭利用酵母真核表達系統可實現外源蛋白的分泌表達優勢，將全能核酸酶基因重組到pPICZɑA 載體上，實現了全能核酸酶重組蛋白在酵母胞外分泌表達，其產量達到200 毫克/升。

5 全能核酸酶的應用

由于全能核酸酶可在廣泛的條件下能保持較高的穩定性和消化活力，高效地降解所有形式的RNA 和DNA，已廣泛地應用于生物醫藥領域。全能核酸酶最典型的用途是除去疫苗、多糖、蛋白等工業生物制品中核酸，美國FDA 對治療用每劑量的生物制品的核酸含量要求低于10 pg，國內相應的要求為低于100 pg。全能核酸酶可以使這些生物制品中的核酸含量符合要求，提高生物制品功效。其次，在蛋白純化過程中，細胞裂解產生的大量核酸增加了裂解液黏度，使下游的生產程序復雜化，全能核酸酶通過降解核酸可有效降低細胞裂解液的黏度，從而提高蛋白得率，改善分離效果。另外，在細胞來源的產物純化過程中，核酸易粘附在細胞產物上，使其顆粒大小或電荷發生改變，引發細胞產物聚集，如外周血單細胞（PBMC）存放過程中的結塊現象，添加全能核酸酶可避免此類情況的發生，有利于提高細胞產物純化效率。在ELISA、色譜分析、雙相電泳和足跡分析等生化分析樣品的制備過程中，用全能核酸酶處理含核酸的蛋白樣品，可提高蛋白的分辨率和回收率。PCR 實驗室核酸污染是造成檢測結果假陽性的主要因素，全能核酸酶通過降解核酸實現實驗室的凈化。在醫學方面，由于核酸酶具有干擾細胞復制的功能，具有明顯的抗腫瘤特性，并且對纖維性囊腫、系統性紅斑狼瘡，兒童氣喘病等疾病也有明顯的療效。

圖1 全能核酸酶單聚體結構

6 小結與展望

圖2 全能核酸酶二聚體結構

圖3 DNase I，葡萄球菌核酸酶以及SMNE 的切割位點

全能核酸酶應用范圍廣泛，作用效力強，不僅在工業、生物醫藥領域有突出表現，也可以在畜牧生產中派上用場，全能核酸酶可降解豬血漿蛋白粉攜帶的病原微生物核酸，尤其是非洲豬瘟病毒核酸，可提高豬血漿蛋白的飼用安全，降低動物疫病傳播風險，維護豬血漿的畜牧生產價值。另外全能核酸酶與蛋白酶聯合應用，有望成為新型的環保生物消毒劑，首先通過蛋白酶降解病原微生物的外膜蛋白使其核酸暴露，全能核酸酶進一步發揮降解核酸作用，從而達到消毒效果，與傳統化學消毒藥相比，對機體無毒副作用，不污染環境，是一種潛在的理想綠色消毒制劑。