水楊酸調控乙烯反應因子提高雛菊切花保鮮效果

陳星星 張治平

摘要：乙烯反應因子（ERFs）是植物特有的轉錄因子，在乙烯釋放、脅迫防御等生理生化反應中發揮重要作用。然而關于雛菊（Bellis perennis L.）ERF基因家族的組成特征及其在切花過程中的功能作用知之甚少。結果表明，在雛菊共鑒定出7個乙烯反應因子（BpERF），其蛋白質長度110～329 aa，相對分子量2.61～5.25 ku，等電點4.72～8.36。系統發育和蛋白質序列比對結果表明，這7個BpERF可分為3個亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c）并具有AP2保守結構域和YRG、RAYD等保守序列?；蚪Y構和啟動子分析表明，BpERF的啟動子中含有許多細胞分化和植物激素相關的順式元件，其中ERF-c亞家族的BpERF005同時含有衰亡順式作用元件和水楊酸響應元件，表明BpERF005在切花保鮮中可能響應水楊酸（SA）的施用。轉錄組分析（RNA-Seq）表明，BpERF005在SA處理下轉錄水平明顯降低，qRT-PCR結果與RNA-Seq結果高度一致；此外，SA處理下，BpERF005在花序中的表達模式與乙烯排放速率呈顯著（P=0.024 9＜0.05）線性正相關關系，表明BpERF005是SA調控雛菊乙烯合成的指示基因，且施用SA顯著增加了雛菊切花的瓶插壽命。綜上，水楊酸可通過抑制雛菊切花過程中乙烯反應因子（BpERF005）的轉錄表達，從而降低乙烯排放速率以延長雛菊切花的瓶插壽命。

關鍵詞：雛菊；瓶插壽命；水楊酸；乙烯反應因子；全基因組；基因表達水平

中圖分類號：S682.1+10.9+3? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）13-0041-08

雛菊（Bellis perennis L.）是世界花卉貿易中最具商業價值的觀賞花卉之一，由于其花色艷麗、花姿優美、花型洋溢大方而廣受市場追捧［1］。然而，雛菊品種因花朵面積較寬，蒸騰失水量大造成花瓣散亂等現象而不耐插切花，且當其浸在花瓶溶液時，莖端處易被微生物附生污染，使得瓶插壽命進一步縮短［2］。采后導致衰老進程加快是影響切花適銷性的關鍵因素，引起采后衰老的關鍵因素包括碳水化合物消耗嚴重、呼吸速率升高、莖部微生物附生積水、花序失水、活性氧累積、抗氧化系統活性降低及乙烯（ET）產量增加［3］，其中花朵的衰老與乙烯釋放速率、單位產量密切相關，衰老速率對乙烯合成高度敏感并受乙烯轉導通路調控［4］。

在植物體中，乙烯的生物學功能通過乙烯信號轉導途徑實現，乙烯反應因子（ERF）作為乙烯信號轉導通路中最重要的元件，在乙烯的生物合成及功能表達中起著至關重要的作用［5］。ERF位于乙烯信號通路下游，是典型的植物特異性轉錄因子，同時也是植物AP2/ERF超家族的重要成員，參與植物生理生化和非生物脅迫反應［6］。AP2/ERF家族成員的特征是存在一個AP2-DNA結合域，該結構域可與下游啟動子區域的-GCC-盒、DRE或C-重復序列的順式元件相互作用從而直接或間接作用于靶向基因，根據AP2-DNA結合域的數量和基序相似性，ERF家族可分為5個亞家族［7］。近幾十年來，從植物中分離和克隆了許多ERF基因，這些基因參與調控生物體生理發育、細胞增殖、脅迫反應和激素合成，但有研究表明，并不是所有的ERF皆作用于乙烯的生物合成，有些ERF可能對植物相關生理途徑無任何功能［8］，目前關于菊花ERF的組成及功能鮮有研究涉及。

水楊酸（SA）是一種廣泛存在于植物中的酚類化合物，是被廣泛使用的植物生長調節劑。在高等植物中，SA通過莽草酸循環的苯丙氨酸途徑和異分支酸途徑合成，苯丙氨酸途徑在細胞質中起作用，而異分支酸途徑在葉綠體中表達［9］。SA可介導植物的防御反應并調節多種生理過程，如種子發芽、激活免疫系統、開花和衰老［10］。近年來，由于SA在水果和蔬菜采后質量保持方面表現出良好效果，受到了越來越多的關注。據報道，SA可通過抑制乙烯前體物的轉化以介導乙烯的生物合成，從而影響花卉采后的衰老代謝進程［11］。以上研究為水楊酸應用植物保鮮提供了一定的理論依據，然而關于水楊酸如何介導乙烯合成的機制尚不清楚，且關于水楊酸如何作用于菊花的采后保鮮更是鮮有涉及?；诖?，本研究挖掘了對雛菊ERF的組成與特征，并探索了水楊酸對雛菊靶向ERF的影響。研究結果可為揭示水楊酸應用切花保鮮提供分子理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗方法

試驗于2022年1—3月在河南農業職業學院園藝培養室中進行。供試雛菊品種為塔索BEL0201，來自河南省洛陽千卉谷農業有限公司。

選擇發育相近、舌狀花完全開放、花朵健壯、花莖硬挺的雛菊作為試材，將雛菊根莖于水中剪切成斜口型，保留花梗長度約20 cm，將切花插入裝有100 mL常規培養液（無水楊酸）的三角錐形瓶（250 mL），雛菊花莖切口懸于培養液中，每瓶5株，插瓶深度約5 cm，瓶口采用透氣薄膜封住，每3 d更換1次營養液，并在0、3、6、12、24、48、96、120 h取樣保存于-80 ℃環境。

水楊酸處理即更換培養液時噴施5 mL的 100 mg/L 水楊酸溶液，該水楊酸質量濃度已被證明是菊花切花保鮮的最佳濃度［12］，對照加入相同體積蒸餾水。

1.2 BpERF基因家族成員的鑒定及理化性質分析

從菊科基因組庫（http：//www.amwayabrc.com/）中下載菊花全基因組數據，基于HMMER（v3.1）平臺檢索菊花ERF家族成員［13］，將搜索結果提交到NCBI保守域搜索平臺（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。手動篩選含AP2結構域序列，初步篩選得到229條序列，分別依次命名為AP2/ERF001～AP2/ERF229。去除殘缺及未定義序列，共得到7條完整序列，分別命名為BpERF001～BpERF007，將BpERF提交至蛋白質理化性質程序（https：//zenodo.org/record/）以預測全長氨基酸序列的理化性質，同時BpERF蛋白質序列提交WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預測亞細胞定位。

1.3 BpERF系統發育、基因結構、保守基序和順式作用元件分析

通過擬南芥數據庫（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）獲取擬南芥的ERF基因家族的氨基酸序列。將BpERF與同源擬南芥氨基酸序列（AtERF）數據共同整合為特定的fasta文件，并借助MEGA-X在線軟件（https：//www. megasoftware.net/）采用鄰接法構建系統發育樹，Bootstrap設置為2 000，其余參數為默認值［14］。

基因結構文件取自菊花基因組數據庫Gff3文件，利用MEME在線工具（https：//meme-suite.org/meme）對保守基序進行預測，簡介模體（Motif）設置為6，其余參數默認?；赑lant CARE線上工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be）以預測BpERF的啟動子順式調控作用元件。

1.4 BpERF轉錄組數據的獲取與分析

通過基因組數據庫下載的7個BpERF轉錄組數據和NCBI的序列讀取數據庫（SRA）下載雛菊的轉錄組數據（PRJNA548462），將下載的SRA默認格式文件轉換為fastq文件，再導入fastqc軟件獲取質控報告。fastq文件利用trim galore、kallisto軟件指令去除低質量數據并進行序列對比，以獲取TPM表達量［15］，通過TBtools在線工具對提取的AP2/ERF家族成員表達量數據構建熱圖。

1.5 染色體定位和同線性分析

使用TBtools的Map Genes On Genome From Sequence Files方法定位7個BpERF的染色體位置。使用的預序列從Phytozome在線平臺獲?。╤ttps：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。采用TBtools的Circos-plots工具鏈接多組連鎖群（LG）之間的關系進行共線性可視化，使用默認參數的MCScanX并設置為pBLAST≤10-5［16］。

1.6 RT-qPCR、RNA-Seq驗證表達數據及乙烯排放速率測定

利用氣相色譜儀同步測定雛菊花瓣的乙烯釋放速率，具體步驟參考史國安等的方法［5］。RNA測序用于交叉驗證RT-qPCR的基因表達數據。每次處理完成后，分別從3株植株中收獲莖、葉和花序組織，立即冷凍在液氮中，并儲存在-80 ℃環境用于RNA分離和RT-qPCR分析，提取、純化雛菊RNA，將純化基因分為2個部分，一部分用于RT-qPCR分析，其看家基因、反應程序及條件參照李菲等的研究［17］，目標基因序列相關引物采用Primer 5.0軟件設計（F：5′-ATCATCTCTCTCTTCTCTGT-3′、R：5′-CAAACCAAACCGAAACGA-3′），其相對表達水平采用2-ΔΔCT斷層掃描方法算法表示。另一部分運送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，使用Illumina Novaseq 3000進行RNA-Seq測序文庫構建和數據分析，基因轉錄水平的結果以每百萬讀數（TPM）的轉錄物水平表示。

1.7 數據處理與分析

借助Excel 2016進行數據預處理，采用DPS 14.0進行單因素方差分析及t檢驗，Origin 9進行相關圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 BpERF基因家族理化性質特征分析

將BpERF基因序列與擬南芥數據庫中的ERF蛋白序列進行BLAST對比，結果表明，在雛菊的基因組中共鑒定出7個ERF基因，分別命名為BpERF001、BpERF002、BpERF003、BpERF004、BpERF005、BpERF006和BpERF007（表1）。由表1可知，BpERF家族蛋白質長度范圍為110～329 aa，蛋白質相對分子量在2.57～5.25 ku之間，等電點范圍為4.72～8.36，其中BpERF001、BpERF002、BpERF004為酸性蛋白，其他則為堿性蛋白。亞細胞定位預測顯示，BpERF001、BpERF004位于細胞質中，BpERF002、BpERF003、BpERF006位于細胞核中，BpERF005、BpERF007位于線粒體中。

2.2 BpERF系統發育、保守基序和氨基酸序列比對分析

采用鄰接法分析7個BpERF和5個擬南芥直系同源物之間的系統發育關系，對BpERF全長蛋白質序列進行多重比，根據結構域分析，將7個BpERF基因分為3個亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c），其中BpERF002、BpERF003、BpERF006屬于ERF-a亞家族，BpERF007屬于ERF-b亞家族，BpERF001、BpERF004、BpERF005屬于ERF-c亞家族。

分析了7個BpERF的非翻譯區（UTR）、編碼序列（CDS）和內含子的基因結構。結果表明，除 ERF-a 亞家族的BpERF003、ERF-b亞家族中的BpERF007均具有1個內含子外，其他同一亞家族的BpERF基因內含子數目相同，且外顯子/內含子結構相似（圖1-B）。MEME預測的保守基序顯示，motif-1在7個BpERF蛋白中都表現出保守性（圖1-B）。此外，Motif-3只存在于ERF-a亞家族成員中，而motif-5只存在于ERF-c亞家族成員中，且ERF-c亞家族的BpERF001不具有motif-5。結構域序列進行的多重比對表明，全長氨基酸序列相似的BpERF在AP2結構域上存在高度相似性（圖1-C）。這些發現表明，BpERF轉錄因子的結構和功能具有相似性，尤其是屬于同一亞家族的BpERF轉錄因子。

2.3 BpERF共線性分析

本研究中，基于ERF基因序列特征共得到19個連鎖群（LG），7個BpERF基因分別被定位在Chr02、Chr03、Chr04、Chr05、Chr06、Chr011、Chr018中，且各BpERF的分布無重合定位現象（圖2）?；贛CScanX對菊科和擬南芥包含的ERF基因進行了同線性分析，鑒定出21 519個菊科ERF基因與擬南芥ERF基因具有相似性；而在21 519個菊科ERF基因中發現209個ERF基因全基因組復制現象；在209個ERF基因中發現了83個共線基因（占比3971%），表明該83個BpERF基因存在全基因組復制事件，它們主要分布在2個LG（Chr01、Chr03）上，且BpERF001隸屬于這83個共線基因之一。此外，共線性分析顯示雛菊中的BpERF002、BpERF004和BpERF006隸屬于30個串聯共線的ERF基因，表明BpERF002、BpERF004、BpERF006存在基因串聯重復序列（圖2）。

2.4 BpERF基因啟動子的順式作用元件分析

基于PlantCARE數據庫分析了7個BpERF基因的啟動子的順式作用元件。分析結果表明，BpERF包含10個順式作用元件：Me JA響應元件、赤霉素響應元件、厭氧誘導元件、低溫順式作用元件、下降過程順式元件、衰亡順式作用元件、水楊酸響應元件、生長素響應元件、 防御和應激反應元件、創傷脅迫響應元件；但不同的BpERF在啟動子順式元件組成上存在差異。例如，僅BpERF007存在創傷脅迫響應元件，僅BpERF001、BpERF005、BpERF007特異性存在防御和應激反應元件，僅BpERF002、BpERF003、BpERF005含有衰亡順式作用元件；BpERF001、BpERF004、BpERF006、BpERF007不含水楊酸響應元件。以上結果表明，BpERF002、BpERF003、BpERF005同時具有水楊酸響應原件和衰亡衰亡順式作用元件，意味著這3個轉錄因子可能在切花保鮮中發揮作用。

2.5 基于RNA-Seq分析切花中BpERF的表達模式

由圖4可知，就BpERF在不同組織的表達水平而言，以花序（Flower）和側芽（Shoot）中的表達量高于莖稈（Stem）和葉片（Leaf），其中地上部組織中，各基因在花序中的表達水平相對較高，尤其是BpERF001、BpERF002和BpERF003，而BpERF001、BpERF003和BpERF007在莖、葉中皆超低表達。就基因表達總量來看，BpERF002和BpERF005較高。就水楊酸處理（SA）和無水楊酸處理（CK）的表達量對比結果來看，各基因在莖稈中的表達量差異較??；在葉片中除BpERF005外，其他基因在SA處理與CK的表達量差異也較??；而在側芽中，BpERF001、BpERF002和BpERF004的SA處理與CK間的差異較??；同理，花序中的BpERF001、BpERF002和BpERF006的SA處理與CK間的差異較小?？傮w來看，在任一組織中，僅BpERF005基因的SA處理與CK間差異較大，且均為CK大于SA處理，即SA處理可誘導BpERF005基因發生下調表達，初步表明BpERF005基因可能是雛菊切花過程中調控植株衰老的潛在基因，應在后續研究中予以重視。

2.6 基于RT-qPCR分析目標基因的表達模式對水楊酸處理的響應

由圖5-A可知，BpERF005在各組織中的相對表達量表現為莖稈＜葉片＜花序＜側芽，而施用水楊酸處理總體上沒有改變BpERF005在各組織中的表達模式，僅顯著或極顯著降低了各組織的相對表達量，尤其在花序中。由圖5-B可知，在切花后的120 h中，BpERF005在花序中的表達量呈先升高后降低的趨勢，其表達峰值為切花后的12 h，此后開始逐漸降低，但任一時間點中，水楊酸處理均顯著或極顯著降低了BpERF005的表達水平，尤其在切花后的12 h。

2.7 水楊酸處理對雛菊切花乙烯排放速率及瓶插壽命的影響

由圖6-A可知，切花后雛菊花序的乙烯排放速率與BpERF005在花序中的表達模式基于趨于一致，均呈先升高后降低模式，均在切花后的12 h達到峰值；而在水楊酸處理后期的排放速率與CK相比在任一切花時間點均降低；同時水楊酸處理后雛菊的瓶插壽命為9.1 d（218.4 h），CK為6.5 d（156 h），瓶插壽命顯著延長了62.4 h。對切花后雛菊花序的乙烯排放速率和BpERF005表達量進行線性分析（圖6-B）發現，兩者存在顯著（P=0.024 9<0.05）的線性正相關關系，這進一步顯示BpERF005可能是調控乙烯排放的靶基因。

3 討論與結論

改變遺傳生理、改善瓶插環境及將生物化學策略應用于切花保鮮，以延緩或抑制乙烯的生物合成是延緩切花衰老的主要策略［18］。探索乙烯反應因子組成特征及響應機制，有望提高切花保鮮效果，從而提高觀賞性及經濟效益。本研究中基于HMMER檢索和蛋白質Blast對比發現，在雛菊中共鑒定出7個乙烯反應因子（ERF），ExPASy和WoLF PSORT預測表明，BpERF基因蛋白質長度為110～329 aa，相對分子量為2.61～5.25 ku，等電點為 4.72～8.36；其中BpERF001、BpERF002、BpERF004為酸性蛋白，其他則為堿性蛋白。亞細胞定位預測顯示，BpERF在細胞質、細胞核、線粒體中均有分布。

基于全長蛋白質序列構建的系統發育關系分析表明，7個BpERF共歸屬于3個亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c），其中BpERF002、BpERF003、BpERF006屬于ERF-a亞家族，BpERF007屬于ERF-b亞家族，BpERF001、BpERF004、BpERF005屬于ERF-c亞家族。這與之前研究中得出的結論存在差異：一般而言，高等植物中ERF1往往與ERF4、ERF5基因結構存在差異，所以不歸屬于同一亞家族中［19］；造成差異的原因可能是菊科植物早期基因組發生變異分化的結果［20］。此外，同源性分析表明，這7個基因中只有4個擬南芥同源直系物，雛菊基因數量的增加表明在雛菊進化史中經歷了基因復制事件［21］。在漫長的生物進化史中，全基因組復制事件和串聯復制事件對菊科ERF轉錄因子基因的增加具有重要影響。同線性分析顯示，BpERF001存在全基因組重復，而BpERF002、BpERF004和BpERF006與基因串聯重復相關（圖2）。

本研究中，基因結構分析表明，同一亞家族的基因具有相對相似和保守的內含子/外顯子結構和基序，本研究確定了7個BpERF基因中的6個保守基序，AP2結構域中的保守motif 1存在于所有7個BpERF基因中；而motif 3和motif 5分別在ERF-a和ERF-c亞家族中保守，這個結果支持了系統發育分析和亞科分類的可靠性。多重比對顯示，這7個BpERF蛋白具有AP2結構域和其他保守序列，例如YRG和RAYD元件。大量研究表明，ERF-c亞家族中的蛋白質含有一個保守的第14順序列纈氨酸殘基，AP2結構域中的保守纈氨酸殘基往往決定著DNA與AP2結構域元件的特異性［22］?？傊?，以上結果表明，7個BpERF基因均高度保守，而ERF-c亞家族的成員可能在雛菊脅迫耐受與發育生理中發揮作用。

基因的翻譯、轉錄與表達受順式作用元件和反式作用因子調節［23-24］。本研究結果表明，不同BpERF基因的啟動子包含多種脅迫應激反應元件，如厭氧誘導元件、防御和應激反應元件及創傷脅迫響應元件（圖3）。一些BpERF基因啟動子包含下降過程順式元件、衰亡順式作用元件以及激素（Me-JA、ABA、SA、IAA）響應元件，這表明ERF基因也可能通過調節激素分泌與凋亡代謝網絡從而調控植物的表型衰老［7，25］。此外，啟動子順式作用元件分析發現，BpERF002、BpERF003、BpERF005同時含有衰亡順式作用元件和水楊酸響應元件，意味著該3個轉錄因子可能在水楊酸應用于切花保鮮中發揮作用。

基于RNA轉錄組的相關性熱圖分析表明，不同的BpERF基因在不同組織中的表達模式存在差異，且對施用水楊酸的響應程度也不同。整體而言，不同組織中各BpERF基因的轉錄水平表現為花序＞側芽＞葉片＞莖稈，施用水楊酸條件下，BpERF005的轉錄水平顯著或極顯著下調，qRT-PCR基因表達結果與RNA-Seq轉錄結果高度一致，表明該結果可靠。qRT-PCR分析表明，BpERF005的相對表達量呈先升高后降低的趨勢，其表達峰值為切花后的12 h，且乙烯排放速率與BpERF005表達模式趨于一致，線性相關分析表明，二者呈顯著正相關關系（P=0.024 9＜0.05）。此外，外源施用水楊酸使得雛菊的瓶插壽命顯著延長了62.4 h。本研究僅基于轉錄表達結果驗證了雛菊花序中BpERF005的表達模式及表型生理，然而在不同組織中不同的BpERF的功能租用可能存在差異，通過過表達和基因沉默技術檢測這7個BpERF的具體分子機制是下一步的研究方向。

本研究通過全基因組綜合分析結果表明，在雛菊中共鑒定得到7個乙烯反應因子（BpERF），ExPASy和WoLF PSORT預測表明，BpERF蛋白質長度為110～329 aa，相對分子量為2.61～5.25 ku，等電點為4.72～8.36，且在細胞質、細胞核、線粒體中均有分布。系統發育樹和蛋白質序列的多重比對表明，這7個BpERF可歸屬于3個亞家族（ERF-a、ERF-b和ERF-c）并攜帶AP2保守結構域和YRG、RAYD等保守序列，因此可能受植物激素調節?；蚪Y構和啟動子分析表明，不同BpERF的啟動子中存在許多與細胞分化反應和植物激素相關的順式元件，其中BpERF002、BpERF003、BpERF005同時含有衰亡順式作用元件和水楊酸響應元件，意味著這3個轉錄因子可能在水楊酸應用于切花保鮮中發揮作用。BpERF轉錄組分析（RNA-Seq）表明，與不施用水楊酸處理（CK）相比，水楊酸處理后不同組織中BpERF005的轉錄水平均明顯降低，初步表明BpERF005是SA調控雛菊乙烯生物合成的潛在基因，qRT-PCR結果與RNA-Seq結果高度一致。此外，施用水楊酸處理下，BpERF005在花序中的表達模式與乙烯排放速率存在顯著線性正相關關系，證實了BpERF005是調控雛菊乙烯合成的指示基因，且水楊酸顯著延長了雛菊切花的瓶插壽命。研究結果為揭示乙烯反應因子在雛菊切花衰老過程中的功能提供了分子基礎，也為水楊酸應用切花保鮮提供了理論依據。

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