枇杷外泌體及細胞液基于體外水平的護膚功效研究

李惠華 吳美芳 王偉 徐夙俠

摘 要：探索枇杷（Eriobotrya japonica L.）外泌體及細胞液對體外人皮膚細胞的生物活性，為其在護膚品上的開發提供科學依據。采用超高速離心法和機械破碎法分別獲得枇杷外泌體和細胞液，以CCK8 法檢測不同濃度枇杷葉來源外泌體、枇杷細胞懸浮培養來源的外泌體及其細胞液對人皮膚成纖維細胞（HSF）存活率的影響；對HSF 細胞采用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理進行炎癥造模，選取顯著促進細胞存活率的濃度，后續開展添加外泌體或細胞液處理，進行細胞凋亡及遷移能力檢測。對黑色素瘤細胞（A375）開展外泌體或細胞液處理，進行黑色素含量及酪氨酸酶活性檢測。結果表明：每克枇杷葉含8.54×109 個外泌體顆粒，粒徑86.78 nm；每毫升（約1 g）枇杷懸浮細胞上清液中含8.67×108 個外泌體顆粒，粒徑80.39 nm。濃度為20 μg/mL 時，枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞外泌體、枇杷懸浮細胞液均顯著提高體外HSF 細胞存活率（P<0.05）。與陽性對照（LPS 處理）相比，枇杷葉外泌體濃度為20 μg/mL，枇杷懸浮細胞外泌體濃度為20 μg/mL 和枇杷懸浮細胞液濃度為10 μg/mL 時，均極顯著降低LPS 處理引起的細胞凋亡（P<0.01），均顯著促進細胞遷移（P<0.05）。濃度為5 μg/mL 的枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷懸浮細胞液均可顯著降低體外A375 細胞黑色素含量，枇杷細胞液還顯著降低酪氨酸酶活性（P<0.05）。

關鍵詞：枇杷；外泌體；懸浮細胞；細胞液；護膚功效

中圖分類號：TS209 文獻標識碼：A

枇杷（Eriobotrya japonica L.）為薔薇科枇杷屬植物，其葉及花有清肺止咳、和胃降逆、止渴之功效[1]，是傳統藥食同源植物。枇杷葉（果）提取物、葉原生質體已收錄于《已使用化妝品原料目錄（2021 年版）》。由于枇杷果期（保存期）短，分布地域狹窄，導致果實應用基本停留在鮮食和粗加工產品上，枇杷葉或花則在止咳清熱的中藥組方中長期無新的突破，大大降低了枇杷的高值利用。

研究表明，枇杷的應用還可以拓展到很多領域，如治療尋常型痤瘡[2-3]，卷煙加香[4]，揮發性成分可以直接吸入肺部給藥[5-6]等。目前，有必要結合新熱點和新技術對枇杷的應用進行新的拓展。

外泌體（exosome）首次發現于1983 年，是一種細胞內膜衍生的納米級囊泡，存在于動物、植物以及微生物中[7]。它具有磷脂雙分子層結構而高度穩定，可保護內含物（一般為復雜核酸和特異蛋白）免受降解并運送至受體細胞[8-9]。其自身也具有某些生物活性，如參與基因轉錄調控[10-11]，通過細胞介質傳遞影響其他細胞功能[12]，可作為癌癥、免疫性疾病等早期診斷的生物學標志[13]。

此外，外泌體在跨界細胞或物種間有廣泛的應用前景[14-15]，如間充質干細胞外泌體可促進燙傷后皮膚的恢復及再生[16]；人血小板外泌體可改善面部光損傷和皮膚老化的各種臨床指標，并具安全性和良好耐受性[17]。生姜外泌體可重塑腸道菌群、緩解結腸炎[18]；景天外泌體可抗肺纖維化[19]；牛奶、生姜外泌體可作為天然納米載體以提高藥物利用率[20-21]；外泌體可作為基因或細胞治療中理想的藥物或傳送遞質[22]。外泌體已成為生物學、醫藥學等研究的熱點。

采用枇杷細胞懸浮培養技術生產三萜類次生物質，是不同于現有從枇杷葉提取的另一有效途徑[22-24]。項目組前期研究表明，通過枇杷細胞懸浮培養，細胞內能夠產生幾倍至十幾倍高于枇杷原植株的五環三萜類化合物，原廢棄的細胞培養液中易分離制備豐富的外泌體。目前缺乏枇杷外泌體和細胞液功能的相關研究報道。本研究基于已建立的優良的枇杷懸浮細胞系，分離外泌體及其細胞液，以鮮枇杷葉分離外泌體，探索這3 種材料對體外人皮膚成纖維細胞（HSF）的功效以及對黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響，以期為枇杷細胞今后在護膚品領域的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

已有懸浮培養的枇杷細胞系（早鐘6 號），誘導自幼果，由福建省亞熱帶植物研究所誘導、優化并長期繼代培養，具體技術參見文獻[25-26]。

液體培養基為MS 培養液附加NAA 0.5 mg/L，茉莉酸甲酯（MeJ）375 mg/L，蔗糖2%，pH 5.8，培養條件為：接種量8 g/100 mL，溫度25 ℃，白熾燈400 Lux，轉速130 r/min，于250 mL 三角瓶（裝液量130 mL）中。接種后10 d 收獲。

選取早鐘6 號枇杷頂端第2 對嫩葉，2021 年9 月采收于福建省亞熱帶植物研究所藥用植物資源圃。

人皮膚成纖維細胞（HSF）、人黑色素瘤（A375）細胞購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌體分離及鑒定 采用超高速離心法分離外泌體。對數生長期的枇杷懸浮細胞液250 mL，于4 ℃，5000 r/min，離心5 min，收集上清200 mL（約為200 g）；4 ℃，150 000 r/min，離心120 min，棄上清，預冷PBS 300 μL 重懸沉淀，0.45 μm 濾膜除菌，–80 ℃備用。取枇杷葉片65 g，破壁機研磨獲取汁液，4 ℃，5000 r/min，離心20 min，收集上清；4 ℃，10 000 r/min，離心40 min，收集上清；4 ℃，150 000 r/min，離心120 min，棄上清，預冷PBS 300 μL 重懸沉淀，0.45 μm 濾膜除菌，–80 ℃備用。

利用透射電子顯微鏡Hitachi HT-7700 觀察外泌體形態；采用粒徑分析儀NanoFCM N30E 檢測外泌體的粒徑和濃度信息；利用多功能酶標儀Thermo Varioskan LUX 采用BCA 法測定蛋白濃度，具體步驟如下：（1）在37 ℃中速融外泌體，并迅速加入5×RIPA 裂解液；（2）混勻后在冰上裂解30 min，期間混勻；（3）配制BCA 法測蛋白濃度的標準樣品，并取5 μL 樣品加至BCA 混合液中，混勻；（4）37 ℃孵育30 min，酶標儀上，在562 nm 處測吸光值并記錄；（5）根據標準曲線算出待測樣品的蛋白濃度。

1.2.2 枇杷懸浮細胞液的分離鑒定 取1 g 對數生長期的枇杷懸浮細胞在超凈臺中研磨破碎，加入1 mL PBS 重懸得到細胞液，4 ℃，5000 r/min，離心5 min，收集上清獲得枇杷懸浮細胞液，0.45 μm 過濾除菌，采用BCA 法測蛋白濃度，具體方法同1.2.1，于–80 ℃保存，備用。

1.2.3 細胞培養 人皮膚成纖維細胞（HSF）、人黑色素瘤（A375）在含有1%雙抗、10%胎牛血清的完全培養液（HSF 使用1640 培養基，A375 使用DMEM 培養基），37 ℃、5% CO2 保持飽和濕度培養，細胞密度約80%～90%時進行常規傳代。

1.2.4 CCK8 法檢測細胞活力 HSF 細胞按照5000 個/ 孔鋪于96 孔板， 待細胞貼壁后用10 μg/mL 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理HSF 細胞20 h 進行炎癥造模，添加含或不含外泌體或細胞液的完全培養基處理細胞48 h。模型細胞作陽性對照，正常未處理細胞為陰性對照，設置6 個生物學重復。處理48 h 后，加入CCK8 試劑進行細胞活力檢測，2 h 內讀取OD450 值。HSF細胞按照3×105 個/孔鋪板至6 cm 板，待細胞貼壁后使用。

1.2.5 流式雙染檢測細胞凋亡 采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產的E606336-0020Annexin V 凋亡檢測試劑盒，FITC/PI 雙染法，胰酶消化細胞，1200 r/min 離心5 min 收集細胞，PBS洗滌2 次；195 μL 1×Binding buffer 懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC ， 4 ℃ 避光孵育10～15 min；加入200 μL 1×Binding buffer 洗滌細胞、1200 r/min 離心5 min，棄上清；190 μL 1×Bindingbuffer 懸浮細胞，加10 μL PI 混勻后上機檢測。

設置3 次生物學重復。

1.2.6 Transwell 法檢測細胞遷移能力 （1）取消化HSF 細胞，無血清培養基洗3 次，計數，配成濃度為5×105 個/mL 的細胞懸液；上室每孔加入100 μL 細胞懸液。（2）下室中加入500 μL 含10%血清及工作濃度為10 μg/mL 的LPS 完全培養基。（3）37 ℃培養箱中，培養20 h 后，去除下室培養基，添加含5 μg/mL 外泌體進行處理，48 h后，檢測穿過的細胞數。取上室，以棉簽拭去小室濾膜上的細胞。用PBS 洗后將小室置于4%多聚甲醇固定20 min，棄固定液，用1%結晶紫乙醇溶液孵育30 min 進行染色，用1×PBS 洗后倒置于普通顯微鏡下隨機拍照。設置3 次生物學重復。

1.2.7 黑色素含量檢測 將人黑色素瘤（A375）細胞按照2×107 個/孔鋪板至15 cm 板，待細胞貼壁后添加含/不含外泌體或細胞液的完全培養基處理細胞72 h。將所有樣本蛋白濃度調整為5.77 μg/μL，取100 μL 用于測定OD470。設3 次生物學重復。

1.2.8 酪氨酸酶活性檢測 在總體積3.0 mL 的酶活反應體系中，加入200 μL 含577 μg 蛋白樣本和0.5 mmol/L 左旋多巴底物溶液2.8 mL，充分混勻，37 ℃水浴保溫10 min 后，于波長475 nm處測得樣品吸光度值（A）。設3 次生物學重復。

相對酪氨酸酶活性=加藥處理組A475/空白對照組A475。

1.3 數據處理

采用SPSS 軟件進行數據統計與分析，利用Duncan’s 法進行多重比較。

2 結果與分析2.1 外泌體形態及大小由鮮枇杷嫩葉分離的外泌體（E-leaf-exo）和枇杷懸浮細胞培養液上清分離獲得的外泌體，即枇杷懸浮細胞外泌體（E-suspension-exo）具體形態見圖1，從圖1 可看出二者外部形態類似，均呈現典型的茶托狀外泌體。利用粒徑分析儀檢測外泌體的粒徑和顆粒數（圖2），結合方法1.2.1中起始樣本量，枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細胞外泌體粒徑分別為86.78、80.39 nm；每克枇杷葉含8.54×109 個外泌體顆粒；每毫升（約1 g）枇杷懸浮細胞上清中含8.67×108 個外泌體顆粒。利用該方法獲得的枇杷葉外泌體平均粒徑大于枇杷懸浮細胞外泌體平均粒徑。每克枇杷葉中外泌體的顆粒含量約是每毫升（約1 g）枇杷懸浮細胞上清液外泌體含量的10 倍?；谛螒B上的完整性判斷，以上2 種材料提取的外泌體均可用于后續研究。

2.2 蛋白指標檢測結果

采用BCA 法檢測蛋白濃度，結果表明，枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞外泌體、枇杷懸浮細胞液蛋白濃度分別為0.683、2.766、0.212 μg/μL，并根據此數據進行后續定量實驗。結合以上蛋白濃度和樣本的起始量可知，每克枇杷細胞中含蛋白2.766×103 μg，每克枇杷葉外泌體中含蛋白3.152 μg，每毫升（約1 g）枇杷懸浮細胞上清液提取的外泌體中含蛋白0.318 μg，單位質量的枇杷葉和枇杷懸浮細胞上清液的外泌體蛋白含量相差約10 倍。

2.3 CCK8 法檢測

細胞存活率采用CCK8 法檢測不同濃度外泌體或細胞液對人皮膚成纖維細胞（HSF）存活率的影響，結果如表1 所示，與空白對照（0 μg/mL）相比，20 μg/mL 的枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細胞外泌體能夠顯著提高HSF 細胞存活率（P<0.05），10 μg/mL 枇杷懸浮細胞液能夠顯著提高HSF 細胞存活率（P<0.05）。20 μg/mL 的枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞外泌體、枇杷懸浮細胞液均顯著提高體外HSF 細胞存活率（P<0.05）。枇杷懸浮細胞液10、20 μg/mL 濃度水平組間的HSF 細胞存活率無顯著差異，未呈現出劑量效應。

根據以上結果，選取對細胞存活率有顯著影響的濃度：20 μg/mL 枇杷葉外泌體、20 μg/mL 枇杷懸浮細胞外泌體和10 μg/mL 枇杷懸浮細胞液作為后續研究。后續將采用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理HSF 細胞進行炎癥造模，添加外泌體或細胞液處理，進行細胞凋亡及遷移能力檢測。

2.4 細胞凋亡檢測

流式細胞術檢測結果如圖3 所示，LPS 處理后，右下象限的凋亡細胞比例增加。對HSF 細胞進行炎癥造模，再加入枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞外泌體以及枇杷細胞液處理后，與LPS處理組比較，右下象限的凋亡細胞比例減少。表明HSF 細胞經過LPS 處理后，細胞凋亡水平顯著上調；繼而進行藥劑干預，細胞凋亡均顯著降低，其中，枇杷葉外泌體對細胞凋亡的抑制程度顯著優于枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷細胞液，而枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷細胞液組間無顯著性差異（表2）。

2.5 細胞遷移能力檢測

在Transwell 檢測人皮膚成纖維細胞LPS 炎癥模型中，外泌體或細胞液共孵育48 h 后，細胞遷移能力發生變化，結果如圖4 所示，與對照相比，LPS 處理后細胞遷移的數量明顯減少，外泌體和細胞液處理有恢復炎癥模型中細胞遷移數量的趨勢。研究表明，LPS 處理顯著降低了遷移細胞數量，枇杷葉外泌體干預與LPS 炎癥處理（陽性對照）呈差異顯著，恢復遷移細胞數量至與對照（0 μg/mL，陰性對照）無顯著差異；枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷懸浮細胞液處理均與LPS 炎癥處理呈顯著性差異，能夠恢復遷移細胞數量但顯著低于陰性對照，且枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷懸浮細胞液組間無顯著性差異（表2）。

2.6 黑色素含量檢測

分別采用5 μg/mL 枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷懸浮細胞液處理A375 細胞細胞72 h 后，各處理細胞生長狀態均良好（圖5）。

通過測定細胞黑色素含量和酪氨酸酶（黑色素合成限速酶）活性，由表3 可知，枇杷葉外泌體對黑色素含量無顯著影響。枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷懸浮細胞液均可顯著降低體外A375 細胞黑色素含量，且組間存在差異顯著，枇杷懸浮細胞外泌體的效果優于枇杷懸浮細胞液。而枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細胞外泌體對酪氨酸酶活性無顯著影響，枇杷懸浮細胞液可顯著降低酪氨酸酶活性，枇杷懸浮細胞外泌體有降低酪氨酸酶活性的趨勢但未達到顯著水平。

3 討論

3.1 枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞外泌體、枇杷懸浮細胞液在體外水平的護膚功效

已有研究表明，外泌體在化妝品領域有很好的應用前景，如，間充質干細胞外泌體可以促進傷口愈合還可以顯著促進燙傷后皮膚的恢復及再生[27]；毛囊乳頭細胞球來源的外泌體可促進毛發生長[28]。本研究中枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞外泌體、枇杷懸浮細胞液也表現出在護膚領域有益的方面：均為水溶性；枇杷葉外泌體在人皮膚成纖維細胞LPS 炎癥模型中抑制細胞凋亡以及恢復細胞遷移方面較為突出，適合研發抗炎和促修復功能護膚品；枇杷懸浮細胞液在顯著提高細胞存活率、抑制酪氨酸酶活性方面較為突出，適合研發美白功能護膚品；枇杷懸浮細胞外泌體在所有處理中均與對照有顯著差異，適合研發復合以上功能的護膚產品。

另外，本研究中枇杷葉外泌體并未減少黑色素含量、抑制酪氨酸酶活性，而枇杷懸浮細胞液和枇杷懸浮細胞外泌體卻具有這方面的功能。已有研究表明，枇杷葉酸性成分能夠抑制酪氨酸酶活性且呈現劑量依賴性[29]；枇杷葉中熊果酸能清除自由基、抑制酪氨酸酶活性具有美白功能[30]。

表明枇杷葉的美白歸因于熊果酸等成分。已有研究表明枇杷懸浮細胞中熊果酸等五環三萜類化合物是原植株的幾倍到十幾倍[23-24]，并且轉錄組測序表明熊果酸等三萜類的代謝增強[31]。而生姜外泌體優異的抗炎作用很大程度歸因于外泌體內含物中含有大量6-姜酚等生物活性成分[23]。推測其原因可能是：①枇杷葉外泌體處理達到顯著性差異的濃度應大于5 μg/mL；②原植株枇杷葉中熊果酸等物質含量少，所以其外泌體內不含熊果酸等物質；③而經過懸浮培養之后，枇杷細胞代謝途徑發生變化，胞內富含熊果酸等三萜類物質，推測枇杷懸浮細胞外泌體和枇杷懸浮細胞液可能含熊果酸等物質而具有美白功能。今后可以開展枇杷葉及懸浮細胞來源外泌體組成研究。

3.2 枇杷懸浮細胞外泌體的特性

外泌體作為活性成分成為研究熱點有以下原因：它不僅能激活細胞表面受體，還能將活性物質導入細胞內部，激活細胞內信號；最重要的是它含有miRNA 等核酸成分，microRNA 被磷脂雙分子層結構包裹免受降解，能在核酸層面調節細胞功能[21， 32-33]。而且動物或微生物來源、藥食同源植物來源的外泌體在跨界調節細胞功能的安全性上具有很強的優勢[34-35]。本研究中枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細胞外泌體的平均粒徑約為80 nm，有利于皮膚吸收用，均顯著提高HSF 的細胞存活率，更重要的是其外泌體中包含豐富的microRNA（數據未發表），可能會對皮膚進行基因層面的調控，這一點也是今后的研究方向。另外，本研究首次采用枇杷細胞懸浮培養技術獲得外泌體，區別于以往研究中多采用新鮮植物分離外泌體的方法。本研究表明，從外泌體濃度以及外泌體中蛋白含量角度，每克枇杷葉中的顆粒含量是每毫升（約1 g）枇杷懸浮細胞上清含量的約10 倍。但源自枇杷懸浮細胞的外泌體仍具有其特有的優勢，即枇杷懸浮細胞外泌體可以周年生產；可以通過生物反應器放大培養[23， 36]；且由原廢棄的培養液中提?。ㄨ凌藨腋∨囵B后細胞內富含五環三萜類次生物質，原方法只收獲細胞），增加了枇杷懸浮細胞的使用場景和使用率。

3.3 枇杷懸浮細胞液的特性

采用枇杷細胞懸浮培養技術生產熊果酸等三萜類次生物質，是不同于現有從枇杷葉提取的另一有效途徑。已有研究及項目組前期工作表明，通過枇杷細胞懸浮培養能夠產生幾倍至十幾倍高于枇杷原植株的五環三萜類化合物[23-24]，并且通過此途徑產生的五環三萜類化合物已證實具有消炎[37]、抑制高血糖高血脂[38]、體外抗肝癌細胞[24]等功能。如，其主要成分委陵菜酸含量約是枇杷葉片中含量的18.40 倍，且為培養細胞干重的6%以上[24]。從相對含量和絕對含量角度，值得今后以枇杷細胞懸浮系為研究體系進行理論研究和應用研究。但熊果酸屬非水溶性，生物利用率低，限制了其應用[39]?？赡苓@也是市面上鮮見相關產品的原因?；诒狙芯?，枇杷懸浮細胞液和枇杷懸浮細胞外泌體無菌、水溶性、不含色素、具有良好的益膚功能，適合進一步用于研發護膚品，今后還可以通過枇杷懸浮培養，分離制備外泌體和熊果酸等，以其外泌體為載體裝載其熊果酸等成分或microRNA，以進一步增強其功效。

3.4 枇杷作為藥食同源植物的高值應用

植物藥是中藥的主要組成部分，由于中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點，許多中藥的有效成分及作用機制仍未得到有效闡釋[40]。枇杷作為藥食同源植物，在以往中醫藥利用中多為組方[1-3]，組方成分或協同或拮抗，功效模糊，很大程度制約了枇杷的利用。本研究將枇杷外泌體或細胞液以蛋白含量進行科學量化，功效明確，成份簡單，低劑量，不僅可以用作組方還可以單方使用，為枇杷作為中藥藥方在更廣泛領域的利用提供科學依據。

4 結論

本研究分離了枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細胞來源的外泌體和細胞液。枇杷外泌體和細胞液能夠促進體外HSF 細胞生長，抑制細胞凋亡，促進細胞遷移，適合研發抗炎和促修復功能護膚品；懸浮細胞來源的枇杷外泌體和細胞液可以降低體外A375 細胞黑色素含量，細胞液同時還抑制酪氨酸酶活性，適合研發美白功能護膚品。研究結果對今后這3 種材料在護膚品上的應用具有參考意義。

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