Copine7蛋白在牙、牙周組織發育與再生中的作用

楊 玥,趙溟昱,謝旭東,王 駿

1999年,Savino等[1]最早在散發性乳腺癌研究中發現Copine 7(CPNE7)蛋白。近年來研究發現,前成釉細胞條件培養基(preameloblast-conditioned medium,PACM)能誘導牙源性間充質干細胞分化,具有促進牙本質和牙骨質形成的作用[2-4]。2011年,Lee等[2]在PACM中檢測到CPNE7蛋白,并發現CPNE7蛋白能顯著促進成牙本質細胞分化標志物的表達,表明了CPNE7蛋白具有促進間充質細胞分化的潛能?；诖?學者們在牙本質再生、牙周組織再生、骨組織再生及腫瘤領域對CPNE7開展了眾多研究[5]。

1 CPNE7介紹

CPNE蛋白家族是一個進化上高度保守的鈣離子依賴性磷脂結合蛋白家族,其普遍特征為N端包含兩個C2結構域,C端包含一個von Willebrand因子A型結構域[2, 6]。其中N端的兩個C2結構域被認為與鈣離子流入有關[7],von Willebrand結構域參與蛋白間相互作用[8]。目前CPNE蛋白家族包含9個成員(CPNE1～9)。在CPNE2、CPNE6和CPNE7蛋白中,第2個C2結構域負責蛋白質鈣依賴性膜結合,均表現出高鈣離子親和力。CPNE7蛋白通過與成牙本質細胞表面的核仁素蛋白結合[9],介導細胞內吞作用,上調牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和纖毛體成分的含量,促進牙周組織和牙本質的形成[10]。

2 CPNE7的時空表達

2.1 CPNE7在空間上的表達

有學者利用小鼠模型,分析了CPNE7蛋白在胚胎期和出生后的時空表達特征,動態觀察了CPNE7在牙齒發育過程中的表達模式[10]。CPNE7蛋白在前成釉細胞分化為成釉細胞的過程中合成,并在合成后不久分泌至外胚層間充質中,促進間充質細胞先分化為前成牙本質細胞,再分化為成牙本質細胞(圖1)。進一步分析發現,CPNE7蛋白和mRNA同時在牙乳頭和牙源性上皮細胞上表達,證實了牙源性上皮細胞分泌的CPNE7通過上皮-間充質相互作用向間充質細胞轉移,并促進其分化為成牙本質細胞(圖2)。該研究發現,CPNE7在成牙本質細胞、牙本質和前期牙本質中分布均勻,而在成釉細胞中少量表達。

小鼠牙冠形成過程中,CPNE7蛋白在成釉細胞中合成并分泌至間充質,促進成牙本質細胞的分化。牙冠發育后期,牙本質礦物質沉積,CPNE7蛋白在成牙本質細胞中弱表達圖1 CPNE7牙冠發育過程中的作用模式圖Fig.1 Action pattern diagram of CPNE7′s role during odontogenesis

CPNE7蛋白最初在蕾狀期的上皮細胞中表達,帽狀期也可見于牙囊細胞。在鐘狀期,CPNE7蛋白見于整個成釉器中,同時在牙乳頭也有少量表達。在鐘狀期末期,CPNE7蛋白在前成釉細胞和前成牙本質細胞中分泌圖2 CPNE7在小鼠牙齒發育時期的表達Fig.2 Expression of CPNE7 during mouse tooth development

2.2 CPNE7在時間上的表達

Park等[11]通過免疫組化檢測和原位雜交技術,確定了CPNE7在小鼠牙齒發育過程中的定位。在蕾狀期,CPNE7蛋白在口腔上皮細胞中表達,而未在牙源性間充質中表達。在帽狀期,CPNE7蛋白除在牙源性上皮細胞表達外,也有少量在牙囊中表達,但仍未在其他間充質結構中表達。在鐘狀期,CPNE7蛋白在整個成釉器中都有表達,同時在牙源性間充質中少量分泌。在鐘狀期末期,CPNE7蛋白同時在前成釉細胞和前成牙本質細胞中表達(圖2)。

在出生后的牙冠形成時期,CPNE7蛋白定位于成牙本質細胞、牙本質和前期牙本質中,但在成熟成釉細胞和赫特維希上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath,HERS)中弱表達[11](圖2)。在此期間CPNE7蛋白的不連續表達可能有助于牙本質初始礦物沉積。在HERS和根部牙本質形成過程中,CPNE7蛋白在與上皮細胞基底膜接觸的前成牙本質細胞中表達?？傮w來看,CPNE7蛋白的表達水平在成牙本質細胞分化早期上升,在晚期下降,顯示其與早期牙齒發育有關。

3 CPNE7對牙本質、牙周組織修復與再生的影響

3.1 CPNE7可以促進牙本質的形成

3.1.1 誘導牙本質小管空間封閉

CPNE7蛋白可以促進牙本質小管內礦物沉積和牙本質小管空間封閉,進而促進第三期牙本質再生。Park等[12]將CPNE7蛋白應用于牙本質過敏癥模型,并在之后觀察第三期牙本質形成狀況和牙本質小管封閉情況,損傷的牙本質在使用CPNE7蛋白處理后與對照組相比通透性明顯降低。堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)是細胞礦化中的特征分子,成牙本質細胞在CPNE7處理后ALP啟動子活性升高,此外,CPNE7處理犬牙間接蓋髓模型后在電鏡下觀察到牙本質小管被礦物沉淀所阻斷,表明CPNE7對牙本質小管內礦物沉積有促進作用[3]。

3.1.2 自噬誘導作用

CPNE7能通過自噬誘導促進成牙本質細胞分化和第三期牙本質的形成,且新形成的牙本質保留原發性牙本質特征。Lee等[2]發現,CPNE7不僅能通過調控纖毛細胞控制DSPP的表達,促進牙源性間充質干細胞分化成為成牙本質細胞,還能誘導非牙源性間充質干細胞分化后呈現成牙本質細胞特征,表明CPNE7在成牙本質細胞分化中發揮關鍵作用。Park等[12]將CPNE7蛋白應用于牙本質過敏癥模型中,損傷的牙本質在使用CPNE7蛋白處理后有新的第三期牙本質形成,并檢測到新生牙本質表達牙本質涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和神經巢蛋白(NESTIN)。DSP和NESTIN是成牙本質細胞分化的重要標志物,表明CPNE7蛋白誘導產生的硬組織保留了原發性牙本質的特征[13-15]。在比格犬牙的活體間接蓋髓術模型中,CPNE7組剩余牙本質下明顯能觀察到再生的牙本質小管結構[3]。盡管成熟的成牙本質細胞對外部刺激的反應能力較弱,但CPNE7可能會增強其細胞功能并導致管狀牙本質再生。

為了進一步探究CPNE7促進第三期牙本質形成的機制,Choung等[3]將CPNE7重組蛋白(recombinant CPNE7,rCPNE7)應用于暴露的牙本質,以探究該蛋白在體內是否能滲透通過牙本質小管。結果表明,rCPNE7能很好地通過狹窄的牙本質小管快速滲透并擴散到牙本質液中。CPNE7蛋白可能通過刺激小管中的成牙本質細胞分化,從而促進第三期牙本質的形成。Park等[16]發現,細胞自噬標志物微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)在成牙本質細胞發育中表現出與CPNE7相似的表達模式,CPNE7處理增強了LC3-Ⅱ表達。進一步研究發現,CPNE7不但通過誘導自噬上調DSP和牙本質基質蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)激活成熟牙本質細胞活性,還上調成牙本質細胞中表達的NESTIN和微管相關蛋白(microtubule-associated protein tau,TAU),并可能參與細胞重塑,刺激成牙本質細胞突伸長。此外,經過CPNE7蛋白處理的成牙本質細胞中脂褐質減少,表明CPNE7介導的自噬作用可能通過清除細胞有絲分裂產生的代謝產物,幫助恢復細胞功能。

3.2 CPNE7可以促進牙周組織的再生

多項研究表明,CPNE7在促進牙周組織再生方面有重要作用。Yu等[4]將比格犬前磨牙進行完全脫位和延遲再植處理,并徹底刮除其牙根表面的牙周膜和牙骨質以探究牙周組織缺損時,CPNE7蛋白在促進其再生方面的作用。實驗設置CPNE7蛋白處理組、PACM培養基處理組、CPNE7蛋白滅活處理組,并設置牙周膜和牙骨質刮除的陰性和陽性對照。結果顯示,CPNE7蛋白處理組與其他實驗組相比,牙周膜纖維垂直于根面埋入牙槽嵴中,與天然牙類似,但其新生牙周膜的質量差異無統計學意義。在CPNE7蛋白滅活處理組中,牙骨質形成明顯減少,但仍然高于陰性對照組,表明CPNE7蛋白雖與牙周膜再生無明顯關系,但可能參與牙骨質再生,在牙周組織修復中有積極作用。Choung等[17]在體外評價CPNE7對牙囊細胞、牙周膜干細胞和牙髓細胞的影響,發現CPNE7可能通過調節牙周膜干細胞在骨質上的附著和促進牙周膜纖維垂直排列于新形成的牙骨質和牙槽骨,而在牙周再生中發揮功能性作用。

最新的研究證實,CPNE7促進牙周組織再生的機制可能與TAU蛋白有關。TAU能通過重組肌動蛋白-微管網絡與微管的不穩定結構域結合,在細胞骨架的形成與穩定中發揮重要作用[18]。Bai等[18]在體外研究中發現,CPNE7在細胞中與TAU空間表達的定位相同,并能誘導TAU的表達。隨后在小鼠和比格犬體內實驗中證明,CPNE7能通過調節TAU與牙骨質附著蛋白,介導細胞骨架重組,影響牙周膜在牙槽骨上的附著,使錯位的牙周膜纖維重排整齊,從而有助于牙周膜再生。

4 CPNE7的衍生物

4.1 CDP4

Lee等[19]根據CPNE7蛋白序列結構分析,從CPNE7蛋白序列C2結構域的C端到von Willebrand因子A型結構域選擇出6條短肽CDP1～6,集中在CPNE7蛋白的321～360位。其中CDP4(氨基酸序列為VNPKYKQKRR,相對分子質量為1 315)表現出較低的細胞毒性、較好的細胞滲透性和成骨能力。有學者發現,CDP4能顯著提高體外人牙髓干細胞成骨分化標志物pSmad/Smad蛋白、骨鈣蛋白、堿性磷酸酶、RUNX2蛋白表達[15,20],且效果接近完整的CPNE7蛋白。茜素紅染色結果顯示,CDP4提高鈣沉積水平效果甚至高于CPNE7蛋白。以上研究提示CDP4序列可能是CPNE7蛋白中與細胞滲透性和成骨分化有關的關鍵序列。體內外研究數據都支持,CDP4的促成骨作用與目前最有效的促成骨藥物骨形成蛋白2(bone morphogene-tic protein 2,BMP-2)相近,有潛力作為BMP-2的替代藥品應用于骨組織工程領域。

與完整蛋白相比,合成肽在再生治療中能有效避免免疫原性、體內降解、致癌等不良反應,具有成骨效率高、選擇性高、累積風險低和交叉反應性高等優勢。此外,CDP4在工業生產中更易合成、優化和處理,具有更高的商業潛力。

4.2 CPNE7-DP

Lee等[21]設計并合成了一種穩定、成本低且易操縱的功能性肽CPNE7-DP(包含對應于CPNE7蛋白344～353位的一段合成肽,氨基酸序列為KYKQKRRSYK),可模仿CPNE7蛋白的功能。在Lee等設計的比格犬前磨牙牙本質暴露模型中,CPNE7-DP對不同程度的牙本質暴露都表現出促進修復性牙本質形成和牙本質小管封閉的作用,且新生的硬組織表現出原發性牙本質的特征,表明其不僅促進新生成牙本質細胞分化,還能重新激活休眠狀態的成牙本質細胞,使其分泌牙本質基質。而在Bai等[18]的體外研究中發現,CPNE7-DP等能直接上調骨質附著蛋白的表達水平,并在犬類三壁骨缺損模型中修復牙周膜的結構與功能,在牙周組織的修復方面也表現出良好的應用前景。此外,CPNE7是通過核仁素介導的內吞作用進入細胞,而CPNE7-DP可以直接穿過細胞膜。CPNE7-DP在多種條件下保持穩定,是一種更為穩定的細胞穿透肽。

5 CPNE7及其衍生物的臨床應用前景

多項研究證實CPNE7蛋白能顯著降低牙本質通透性,在牙本質敏感癥(dentin hypersensitivity,DHS)的治療中顯示出重要的應用潛能。DHS是暴露的牙本質對外界刺激產生的酸痛不適感,難以預防,且治療過程痛苦[22]?；谝后w動力學理論[23-24],目前臨床上減輕DHS疼痛的主要方法是通過阻塞牙本質小管內液體流動,從而阻斷各種刺激的侵入[25],但是傳統的治療方法并不理想[26]。在Park等[12]構建的牙本質暴露模型中,CPNE7蛋白能誘導第三期牙本質的再生,促進牙本質小管封閉并顯著降低牙本質通透性,能有效減輕DSH的癥狀,顯示了CPNE7蛋白在DSH的治療中的重要潛力。對于牙本質小管封閉的原因,目前有兩種可能的解釋[3]:一種是成牙本質細胞在CPNE7蛋白的刺激下在牙本質小管內礦化;另一種是CPNE7蛋白因其高鈣離子結合能力與牙本質液中的鈣離子直接反應。

目前已有大量有關生物牙本質再生方面的研究,其中大部分研究表明:第三期牙本質表現出骨樣牙本質特征,成牙本質細胞包埋于形成很快的間質中,細胞變性后在該處遺留一空隙[27]。骨樣牙本質礦物密度低于管樣牙本質,無法起穩固的支持保護作用[28]。此外,骨樣牙本質中牙本質小管數目明顯少于正常牙本質,而多項研究表明牙本質小管在牙齒防御機制中起重要作用[29-31]。CPNE7誘導產生的牙本質具有管樣牙本質特征,新生牙本質中DSP和神經巢蛋白具有良好的生理活性。同時CPNE7蛋白能促進牙本質小管內的礦物沉積,降低牙本質通透性,在治療牙本質缺失方面有重要的臨床應用前景。

牙周組織再生是通過修復因牙周疾病或外傷受損的牙周組織,還原其原始狀態,獲得牙周組織結構和功能的重建[32]。體外研究證實CPNE7可通過調節牙周膜纖維的排列促進牙骨質形成,在牙周組織修復中具有一定的應用前景,但具體的作用機制仍有待進一步研究[4,16-17]。

除在牙、牙本質修復方面的作用外,最新的研究指出CPNE7可促進口腔鱗狀細胞癌轉移。間充質干細胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)是腫瘤微環境的重要組成部分,MSCs與腫瘤實質細胞的相互作用在腫瘤轉移中起到關鍵作用[33-34]。越來越多的研究證明,MSC通過分泌特定的細胞因子影響腫瘤的轉移進程[35]。Ji等[36]通過實驗證明,CPNE7可以與口腔鱗狀細胞癌間充質細胞表面的核仁蛋白、Iκ?α蛋白結合,激活NF-κB通路,促進p65的胞內轉移和IκBa磷酸化,調節間充質細胞分泌CXCL8,促進口腔鱗癌細胞的轉移。因此,間充質干細胞中的CPNE7可能成為口腔鱗癌的潛在治療靶點。

6 總 結

綜上所述,CPNE7蛋白在促進間充質細胞分化、成牙本質細胞形成、牙本質和牙骨質再生的過程中均發揮重要的作用,顯示其在牙本質損傷和牙周缺損的臨床治療中可能的應用潛力。然而,CPNE7蛋白促進牙本質和牙骨質修復的具體作用機制尚未明確。

目前研究主要關注CPNE7蛋白對牙本質的作用及其機制,而關于其在牙周組織再生中的作用及機制的研究較少,有少量文獻揭示其與口腔鱗癌轉移的關系,但CPNE7的細胞毒性和致癌作用仍有待進一步的研究。另一方面,大多數研究僅僅對CPNE7蛋白的作用作出定性的探討,未對其使用量、作用方式和作用時間做進一步的拓展。

由于CPNE7蛋白成本高昂、分子量較大等限制,具有易于合成、性能更佳優勢的CPNE7蛋白衍生物更具有臨床應用潛力?；贑PNE7蛋白衍生的功能肽因其各方面性能的不同,可能將滿足多樣化的臨床促牙本質和牙周組織再生需求。