SSR分子標記在紫薇屬植物中的應用研究進展

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摘要 紫薇屬植物約60種，由于其花色艷麗，花期長達3個月，且枝葉具有凈化空氣的能力，是著名的園林花卉物種。近年來，由于紫薇屬新品種較多，難以分析其親緣關系，而SSR分子標記技術憑借穩定性好、多態性高的特點，在紫薇屬品種間展現了廣闊的應用前景。介紹了SSR標記的基本原理、特點和開發方法，綜述了SSR標記在紫薇屬遺傳多樣性及親緣關系、雜種純度鑒定、遺傳連鎖圖譜與DNA指紋圖譜中的應用。分析SSR標記的特點和基本原理，旨在更全面分析SSR分子標記的優劣勢，為今后SSR應用于紫薇屬其他品種中提供參考，同時也為SSR分子標記在紫薇屬中的應用提供理論依據。

關鍵詞 紫薇屬植物；SSR標記；遺傳多樣性；雜種純度鑒定；遺傳圖譜

中圖分類號 S 685.99文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2023）15-0014-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.004

Advances in the Application of SSR Molecular Markers in Lagerstroemia

HUANG Jian-rui， MIAO Shen-yu

（School of Life Sciences， Guangzhou University， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract There are about 60 species of Lagerstroemia， which is a famous garden flower species because of its bright color， flowering period of up to 3 months， and its branches and leaves have the ability to purify the air. In recent years， due to the majority of new varieties of Lagerstroemia， it is difficult to analyze their genetic relationship， and SSR molecular marker technology has shown a broad application prospect among varieties of Lagerstroemia with its good stability and high polymorphism. This paper briefly introduces the principle， characteristics and development methods of SSR molecular markers， and summarizes the applications of SSR markers in Lagerstroemia genetic diversity and kinship， hybrid purity identification， genetic linkage map and DNA fingerprinting. The purpose of analyzing the characteristics and basic principles of SSR markers is to analyze the advantages and disadvantages of SSR molecular markers more comprehensively， so as to provide a reference for the application of SSR in other varieties of Lagerstroemia in the future， and also provide a theoretical basis for the application of SSR molecular markers in Lagerstroemia.

Key words Lagerstroemia；SSR markers；Genetic diversity；Hybrid purity identification；Genetic map

紫薇屬（Lagerstroemia L.）為千屈菜科（Lythraceae），全球約60種，多為落葉或常綠灌木或喬木，分布于亞洲東部、東南部、南部的熱帶、亞熱帶等地區［1］。目前我國紫薇屬共有25種，除中國植物志記載的18種外，還包括安徽紫薇（L.anhuiensis）、小果紫薇（L.minuticarpa）、小葉紫薇（L.parviflora）、勐臘紫薇（L.menglaensis）、菱萼紫薇（L.turbinata）、密毛紫薇（L.densa）和屋久島紫薇（L.fauriei）［2-6］。目前，世界上已培育出500多個品種［7］。紫薇屬植物花色艷麗，花期長達100 d，具優良的觀賞價值，因此其在園藝和園林應用中有重要價值，常被用作行道樹或盆栽。紫薇屬植物樹干較為平滑、堅硬，且防腐性高，可在家居建材中使用［8］。葉片能夠吸收一定量的有毒氣體，具有凈化空氣的能力，可改善城市或園林中的空氣質量［9］。此外，紫薇屬植物有一定的藥用價值。Judy等［10-11］發現大花紫薇（L.speciosa）中含有的萜類物質可用于治療糖尿病?？v偉等［12］發現大花紫薇種子油是一種值得開發的保健油脂。憑借優良的觀賞價值、生態價值及藥用價值，紫薇（L.indica）已被12座城市列為市花［13］。

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）是指簡單串聯重復序列，由1～6個堿基組成，又稱微衛星DNA。SSR長度為100～300 bp，其廣泛分布于真核生物基因組的編碼區和非編碼區，有重復性高、分布均勻、多態性好的特點［14］。DNA分子標記是指在不同生物個體或種群基因組之間直接反映出不同生物個體或種基因組之間的差異特征的 DNA片段，它是利用 DNA分子的多態性來識別各種物種的生物技術。隨著現代生物技術發展，現階段已開發多種分子標記手段，如單核苷酸多態性標記（single nucleotide polymorphism，SNP）、限制性片段多態性標記（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴增片段長度多態性標記（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和微衛星標記（SSR）［15］。SSR由于豐富的多態性已成為繼單核苷酸多態性之后用于分析物種遺傳多樣性最有力的生物技術手段之一［16］。SSR具有重復次數多的特點，在同一物種的不同個體基因型間差異很大，呈現高度多態性，且穩定性好，是用于分析種下居群遺傳多樣性的有力工具［17-20］。微衛星已被證實在植物中具有較高的信息量，并且帶有位點特異的分子標記［21-22］。SSR標記已廣泛應用于群體遺傳學、分子育種和親緣關系鑒定研究［23］。

該研究從SSR分子標記的特性和原理入手，綜述了SSR分子標記在紫薇屬植物中的遺傳多樣性、雜種純度研究、遺傳連鎖譜圖中的應用，為今后在紫薇屬中SSR分子標記的開發及應用提供理論支撐。

1 SSR分子標記的特性

1.1 SSR分子標記的基本原理

SSR分子標記是一種利用直接分析遺傳材料的多態性來識別其核苷酸排法和外部狀態表達法則的技術。簡單重復序列的高度變異表現為SSR數目的整體或部分變異，同時Schltterer等［24］研究發現，DNA復制過程中的“鏈滑”（strand slippage）造成同一基因座在特定物種的群體中能有很多等位基因，呈現多個位點多態性。SSR在種間或個體間的多態性與這些特異區域息息相關。

SSR分子標記在設計引物時是以微衛星序列兩端的保守序列為依據，對含有SSR的基因組DNA序列進行PCR擴增。電泳可檢測染色顯帶、分析微衛星序列多態性。根據分離片段的大小確定基因排布序列及表型并計算等位基因數目，最終達到鑒定目的［25］。

1.2 SSR分子標記的特點

SSR分子標記在植物鑒定中得到廣泛應用是由于其具有以下特征：①廣泛均勻地分布于真核生物基因組中。Beckman等［26］發現，人類基因組中大約每6 kb就存在1個SSR位點，且SSR既存在編碼區也存在非編碼區。②SSR兩側的序列較保守，有利于設計特異引物；③大部分重復序列無特殊功能，重復序列的重復次數變動不影響生物的正常功能，因而在品種間的變異位點位置不受限制，更具多態性；④根據SSR位點設計出特異引物后，受不定因素影響的可能性較小，結果是穩定的［27］。

簡單重復序列在應用中也展現出一些缺陷，在開發SSR標記前，必須針對微衛星兩端的保守序列來設計引物，耗時長、花費大；且SSR位點可能出現DNA替換、插入、缺失等突變，導致非等位基因的出現［28］。

2 SSR標記的開發方法

SSR標記的開發方法有構建基因組文庫篩選法、濾膜富集法、磁珠富集法、基于PCR技術開發SSR標記法、數據庫篩選法等。

構建基因組文庫篩選法簡單易掌握，是最傳統的獲取SSR位點的方法。該方法是利用提取的DNA片段連接載體后轉化到大腸桿菌（Escherichia coli）中構建基因組文庫，再使用SSR探針與文庫中克隆的DNA雜交，檢測基因組文庫中的陽性克隆，再依據測序結果設計SSR引物［29］。隨后，為解決試驗操作繁雜的問題，人們采取富集步驟的SSR標記開發法，即濾膜富集法、磁珠富集法［30］。該方法通過SSR探針雜交技術對基因片段進行富集，再進行基因文庫富集。Malausa等［31］研究表明，富集文庫測序能夠有效提高SSR分離效率，比不富集方法的提取效率提高300%，與傳統方法相比能夠有效節省開發成本。但富集法同樣需要構建基因組文庫，操作較基于PCR技術開發的方法仍較煩瑣。

為更簡化實驗操作過程，基于PCR技術開發SSR的方法可省去基因文庫構建和磁珠富集，僅需在PCR儀中進行擴增和電泳檢測擴增就能獲得SSR標記。其中包括PAPD-SSR法、PCR-SSR法。Cifarelli等［32］嘗試利用開發的SSR引物與PCR產物進行擴增，并成功分離出SSR。

隨著生物信息技術的提高，利用數據庫篩選法可以避免一系列的復雜實驗操作，研究者可在GenBank數據庫中搜索相關物種的SSR信息［33-34］。雖然通過數據庫搜索SSR位點方便快捷，但是SSR多態性不如構建基因組文庫獲得的SSR多態性豐富。

綜上可知，SSR標記開發方法各有優劣，在研究過程中需根據自身條件合理選擇開發SSR的方法?；赑CR的SSR標記由于其高度的多態性質和可轉移性，已被證明是研究遺傳多樣性和生物親緣關系的有效工具［35-36］。

3 SSR標記在紫薇屬中的應用

遺傳多樣性是指種內個體之間或單一群體內不同個體的遺傳變異總和，遺傳多樣性為種質資源保護和植物利用工作提供理論依據。紫薇屬植物品種多樣，來源復雜，品種鑒定分類較為困難，通常選擇對品種進行聚類分析（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA），從分子角度將品種歸類，進而了解物種的遺傳多樣性和親緣關系［37］。由于近親繁殖衰退，遺傳多樣性評估對于野生紫薇的育種、種質資源管理和保護策略至關重要［38］。

3.1 遺傳多樣性與親緣關系分析

紫薇150年前被引種到美國南部后，采取雜交育種與生物工程育種手段相結合，首次進行紫薇屬植物在國外的育種研究［39］。在國內紫薇品種的基礎上，研究人員也對國外不同花色性狀的紫薇的遺傳多樣性作出了評價，進一步建立了更加完善的紫薇品種鑒定體系。喬中全等［40］對30個國外紫薇品種和8個國內品種的親緣關系進行分析，開發出70個具有多態性的SSR引物，聚類結果顯示，在遺傳相似性系數0.736處，將38個紫薇品種分為3個類群，在0.760處可進一步將38個品種分為7個亞群。遺傳距離和遺傳一致度可評價品種的遺傳多樣性及親緣關系，“淮南速生”和“淮南紅葉”之間的遺傳相似性系數最大則表明兩者親緣關系最近。徐靜靜等［41］分析了國內不同花色的4個紫薇群體共48個樣品，篩選出23個多態性位點，Shannons信息指數和基因多樣性顯示紫薇群體豐富的遺傳多樣性。研究推測紫薇具有較高的遺傳多樣性的原因可能為：紫薇地理分布較廣，通常分布范圍廣泛的物種的遺傳多樣性高于分布范圍較窄的物種；紫薇的異花傳粉的繁殖方式可能導致紫薇出現遺傳漂變。冷嘉文等［42］針對30個來源美國的紫薇品種進行遺傳多樣性分析，開發出的10對引物檢測到10個多態位點，多態位點百分率為100%，并利用聚類分析將紫薇品種歸為4類，該試驗充分驗證了SSR可用于分析紫薇品種的遺傳多樣性和親緣關系。SSR在瀕危物種保護中也有良好的應用價值。尾葉紫薇（L.caudata）是紫薇屬中僅有的具有花香的物種，其也是培育具花香的紫薇屬新品種的重要育種親本［43-44］。由于人類活動已呈瀕危狀態，此前沒有針對尾葉紫薇開發的SSR位點，Cai等［45］第一次從尾葉紫薇中開發了17個SSR標記，并利用這17個位點在其他紫薇屬物種中擴增，大部分位點都能實現擴種擴增，這項研究有助于尾葉紫薇的遺傳多樣性和可持續保護，第一次實現了SSR在紫薇屬瀕危物種中的應用。隨后，Ye等［46-48］先后獲得尾葉紫薇與地徑、株高性狀、葉片外形連鎖的SSR位點，并補全尾葉紫薇的遺傳多樣性信息。綜上可知，SSR分子標記能有效應用于紫薇屬遺傳多樣性研究，為其他品種的遺傳多樣性研究提供理論支撐。

3.2 雜交種純度鑒定

雜交育種是將親本雜交，子代獲得不同的遺傳多樣性，再通過對雜交后代的篩選，獲得具有雙親優良性狀的新品種的育種方式。雜交育種范圍多在種內不同品種間，利用SSR從分子層面檢驗品種純度，具有準確性高，在植物各部位、各個發育階段均可檢測，不受環境影響的優點，在其他物種如棉花（Gossypium hirsutum）［49］、綠豆（Vigna radiata）［50］、粟（Setaria italica var.germanica）［51］中的運用均取得了較好的鑒定結果。對雜交種純度鑒定，能有效確保雜交后代獲得雙親的優良基因，成功達到改良品種的目的。目前紫薇屬新品種篩選主要從花色、抗性、株型等方面篩選。

Pounders等［52］對大花紫薇和紫薇的雜種后代“Princess”“Monia”通過SSR標記進行雜種純度鑒定，得出僅“Princess”為真雜種。Rinehart等［53］采用SSR標記檢驗出多個假雜種，Ju等［54］利用SSR標記鑒定出紫薇和大花紫薇的真雜種。彭嬋等［55］利用大花紫薇和福建紫薇（Lagerstroemia limii）作為父本分別與紫薇品種進行雜交，篩選出15對在親本間具有多態性的引物對51株雜交子代進行雜種純度測試，結果表明，雜交后代中有38株為真雜種。該試驗還將鑒定為真雜種的植株從葉形、株高等形態方面與雙親進行比較，大部分后代的單株表型介于雙親之間?？梢?，SSR標記能夠有效地對紫薇屬后代雜種純度進行檢驗。

3.3 遺傳連鎖圖譜與指紋圖譜構建

遺傳連鎖圖譜是由遺傳重組后的基因在染色體上的相對位置來排列的圖表［56］。遺傳連鎖圖譜由3個步驟構成：選擇作圖群體、對群體的遺傳標記結果進行分析、構建圖譜。利用SSR位點在染色體上的相對位置組成的圖譜，可以幫助利用分子標記所得的遺傳信息來定位基因，從而為基因定位、育種篩選、縮短育種年限提供了理論基礎。SSR標記由于其穩定性高、多態性廣泛等特點，有利于不同連鎖群、圖譜連鎖群的整合，當SSR標記數量足夠多時，構建的遺傳連鎖圖譜能覆蓋整個基因組［57-58］。

劉陽等［59］以屋久島紫薇和3個具有優良觀賞性狀的紫薇品種“Pocomoke”“Creole”“Dallas Red”為親本，選擇100個子代分別采用SSR分子標記進行基因型檢測，結果表明，90%的基因型與孟德爾遺傳定律相吻合，可用于構建紫薇遺傳連鎖圖譜。紫薇F1群體的構建為紫薇屬遺傳圖譜的構建、QTL數量性狀定位的研究奠定了基礎。隨后，劉陽［48］還從35個紫薇品種中開發了10對具多態性的引物，繪制出35個紫薇品種的DNA指紋圖譜。擴增產物的等位基因大小與96個基因型的預期等位基因大小一致，表明來自近緣種的SSR可以用于擴增紫薇。

在此之前，Cai等［60］已利用13對SSR引物針對中國紫薇種質構建了50份SSR指紋圖譜，說明SSR標記能有效鑒定紫薇屬品種。遺傳連鎖圖譜的構建為今后紫薇在觀賞性狀遺傳規律的分析研究中奠定了基礎。

4 結語

綜上所述，SSR標記能夠應用在部分紫薇品種遺傳多樣性分析、親緣關系分析、種子資源鑒定、遺傳連鎖圖譜和指紋圖譜構建中，為今后在紫薇屬中的SSR標記開發提供理論基礎。

SSR標記具有穩定性好、重復性高的特點，在紫薇品種遺傳多樣性分析、親緣關系分析、種質資源鑒定等方面具有重要應用價值，且其在新品種育種方面便于揭示表型與基因之間的關系。但SSR標記也有開發耗時長、實驗煩瑣等缺點，使用SSR引物鑒定需針對每個微衛星兩端的保守序列設計特異性引物。近年來，EST-SSR序列得到廣泛應用，該方法絕大多數標記均只產生一個位點，這與其他可產生多個多態性位點的分子標記相比，降低了標記效率。目前，從轉錄組中提取SSR位點彌補了從基因組中提取成本大的缺點，目前已證明基于轉錄組能成功在紫薇屬植物中獲得SSR位點［61-63］。

聚類分析表明，來自相同地理區域的品種傾向于聚在一起［64］。多項研究表明，分子標記對紫薇屬植物是適用的，長期的地理隔離似乎導致了紫薇種質資源之間的顯著遺傳分化。紫薇種質資源的系統發育關系和遺傳變異為選擇合適的親本進行育種提供了豐富的材料來源，開發SSR標記能夠為紫薇屬構建DNA指紋圖譜、基因定位及克隆等研究奠定基礎。同時SSR標記也展現了在紫薇屬遺傳育種中的巨大潛力和應用前景。

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基金項目 廣東省科技計劃公益研究與能力建設專項資金項目（2018B030320007）。

作者簡介 黃建睿（1997—），女，廣東翁源人，碩士研究生，研究方向：植物資源利用。*通信作者，教授，博士，從事植物多樣性及其保護研究。

收稿日期 2022-07-21