大鼠牙髓組織AIM2炎癥體表達及其與炎癥反應關系

王繼玲　吳廣升　王亞飛

［摘要］目的探討黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥體在大鼠牙髓組織中的分布及其在牙髓炎癥發生、發展中的表達變化。方法通過開髓法建立大鼠牙髓炎癥模型，采用免疫熒光染色檢測AIM2炎癥體在牙髓組織中的表達分布；利用實時定量PCR（RT-PCR）檢測大鼠牙髓組織中AIM2炎癥體基因表達量的變化。結果蘇木精-伊紅（HE）染色顯示單純的開髓可誘發大鼠牙髓炎癥反應，開髓3 d后出現炎性反應并在7 d后出現牙髓壞死。免疫熒光染色顯示，大鼠牙髓組織中有AIM2炎癥體表達，開髓5 d后牙髓細胞層出現明顯陽性表達。RT-PCR結果顯示，開髓術后3 d AIM2基因表達顯著增加（F=1 178.910，P<0.01），下游caspase-1基因表達上調（F=81.224，P<0.05），IL-1β在開髓5 d后顯著上調（F=164.414，P<0.05）。結論AIM2炎癥體存在于大鼠牙髓組織中，并且其表達量與牙髓炎癥反應呈正相關。

［關鍵詞］牙髓炎；黑色素瘤缺乏因子2；炎性小體；大鼠，Sprague-Dawley

［中圖分類號］R781.31［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0407-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.078［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230725.0936.003.html;2023-07-2614：05：47

EXPRESSION OF ABSENT IN MELANOMA 2 INFLAMMATORY BODY IN RAT DENTAL PULP AND ITS ASSOCIATION WITH INFLAMMATORY RESPONSE? WANG Jiling， WU Guangsheng， WANG Yafei （Disease Prevention and Control Section， Qingdao Special Service Sanatorium of the PLA Navy， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］Objective To investigate the distribution of absent in melanoma 2 （AIM2） inflammatory body in rat dental pulp tissue and the change in its expression in the development and progression of pulpitis. MethodsOpening of pulp chamber was performed to establish a rat model of dental pulp inflammation. Immunofluorescent staining was used to measure the expression and distribution of AIM2 inflammatory body in dental pulp tissue， and RT-PCR was used to measure the change in the mRNA expression level of AIM2 inflammatory body in rat dental pulp tissue. ResultsHE staining showed that opening of pulp chamber alone could induce inflammatory response of rat dental pulp; inflammatory response was observed on day 3 after pulp opening and dental pulp necrosis was observed on day 7 after pulp opening. Immunofluorescent staining showed the expression of AIM2 inflammatory body in rat dental pulp tissue， with marked positive expression in pulp cell layer on day 5 after pulp opening. RT-PCR showed that on day 3 after pulp opening， there were significant increases in the expression levels of the AIM2 gene （F=1 178.910，P<0.01） and downstream caspase-1 （F=81.224，P<0.05）， and there was a significant increase in IL-1β on day 5 after pulp ope-ning （F=164.414，P<0.05）. ConclusionAIM2 inflammatory body exists in rat dental pulp tissue， and the changing trend of its expression is positively associated with dental pulp inflammatory response.

［KEY WORDS］pulpitis; absent in melanoma 2; inflammasome; rats， Sprague-Dawley

牙髓炎是口腔常見疾病，因其能引起較為劇烈的疼痛易對工作、學習和生活等方面產生較大的影響，但其發病機制尚不完全清楚。近10余年，因為炎癥體的發現，人們對牙髓炎的發生、發展及轉歸有了全新的認識。已有研究結果表明，在脂多糖等因素刺激下，牙髓成纖維細胞中黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥體的表達增加[1-2]，并隨著炎癥的進展其表達量有一定的升高。然而，目前對AIM2炎癥體在牙髓組織中尤其是體內研究還相對較少。本文通過構建大鼠牙髓炎模型，研究AIM2炎癥體在大鼠牙髓炎癥發生、發展中的作用機制，為后期尋找牙髓炎拮抗劑或治療分子靶點提供理論依據?，F將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

低溫離心機（Centrifuge 5804R，Eppendorf公司，德國）；PCR儀（Mastercyler gradient，Eppendorf公司，德國）；超低溫冰箱（EKY0014595，三洋公司，日本）；Nanodrop 2000分光光度計（ThermoScientific公司，美國）；熒光定量PCR儀（ABI 7500，賽默飛公司，美國）；ODYSSEY雙色紅外線激光成像系統（LI-COR公司，美國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；八聯管（Invitrogen公司，美國）；牙科高速渦輪機手機（NSK公司，日本）；1/2球鉆（松風公司，日本）；氯仿、異丙醇、無水乙醇、RNA酶滅活水（上海士鋒生物科技有限公司）；Anti-AIM2（Santa-Cruz公司，美國）。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠牙髓炎癥模型的建立所用實驗動物為8周齡雄性SD大鼠20只，購于空軍軍醫大學動物中心。100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥固定于鼠板上，用金屬鑷子撐開大鼠下頜，暴露上頜磨牙，用高速渦輪機（不噴水，1/2球鉆）在大鼠上頜磨牙面開髓，開髓深度約為1 mm，待有透紅點時停止磨切，用金屬探針在透紅點加壓，形成穿髓孔。每只大鼠右側上頜磨牙為開髓牙，左側為對照牙。每3只同樣處理的大鼠為1組。開髓組僅依靠物理刺激形成牙髓炎癥反應。根據蘇木精-伊紅（HE）染色后炎癥程度，即組織切片中浸潤的炎性細胞的程度不同分為正常組、3 d組（少量炎性細胞浸潤）、5 d組（大量炎性細胞浸潤）、7 d組（牙髓組織壞死）和10 d組（大部分牙髓組織壞死）。

1.2.2HE染色大鼠給予100 g/L水合氯醛腹腔注射，待完全麻醉后，開胸；用40 g/L 多聚甲醛行心臟灌注，待全身僵硬后，解剖大鼠上頜，取出上頜雙側磨牙及部分上頜骨。將標本置于40 g/L多聚甲醛中固定12 h。常規乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作切片，進行HE常規染色，觀察動物模型牙髓炎癥狀態。

1.2.3免疫熒光染色組織固定包埋制成石蠟切片，常規脫蠟水化后，以PBS（pH值7.4， 0.01 mol/L）洗3次，每次5 min；用甲醇新鮮配制的體積分數0.003 H2O2 孵育15 min；PBS洗3次，每次5 min；胰蛋白酶行抗原修復 37 ℃下孵育30 min；PBS洗3次，每次5 min；體積分數0.10牛血清清蛋白（BSA）37 ℃孵育30 min；加入一抗AIM2（1∶500， 美國Santa-Cruz），4 ℃濕盒中孵育過夜；PBS洗3次，每次5 min；在避光條件下，加FITC標記的二抗（1∶200，英國Abcam），37 ℃孵育30 min；PBS洗3次，每次5 min；加入DIPA（細胞核染色）室溫下孵育3 min；PBS洗3次，每次5 min；體積分數0.10緩沖甘油封片，4 ℃避光保存。熒光顯微鏡下觀察切片（觀察期間應處于避光環境中）。

1.2.4RT-PCR檢測100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，活體進行大鼠上頜磨牙取材，將磨牙小心剝離，去凈周圍軟組織后置于液氮罐中保存。進行mRNA提取時，將牙齒去除，用手術刀片小心刮凈牙齒周圍組織，放入液氮中5 min后置于勻漿器中研磨。

采用TRIzol法提取細胞總RNA，置于-80 ℃冰箱保存備用。應用Takara.RR037A反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板利用PCR擴增試劑盒完成擴增。PCR的反應條件為：95 ℃下變性30 s，95 ℃下5 s，共40個循環；60 ℃下離解30～34 s。以內參照蛋白GAPDH基因水平為默認值1。PCR引物種類及其序列見表1。

1.3統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析。所得計量資料數據以±s形式表示，兩組比較采用LSD法，多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1組織病理學觀察

大鼠上頜雙側切牙的HE染色結果顯示，對照側無處理的牙齒牙髓組織正常，開髓5 d后出現炎性細胞，開髓7 d后聚集了大量的炎性細胞并有部分牙髓組織壞死。見圖1A～C。

2.2免疫熒光染色觀察

熒光顯微鏡下觀察顯示， 健康的大鼠牙髓組織中AIM2主要表達于成牙本質細胞層，而在牙髓成纖維細胞中表達較少（牙髓成纖維細胞層中綠色熒光分布較少且熒光強度較低）；但在開髓5 d后的牙髓組織中，牙髓成纖維細胞中AIM2的表達量有明顯的增加（牙髓成纖維細胞層中綠色熒光分布范圍增加且熒光強度升高）。見圖2A、B。

2.3RT-PCR檢測AIM2、caspase-1和白細胞介素1β（IL-1β）的基因表達水平

單因素方差分析結果顯示，5組間AIM2、IL-1β、caspase-1基因表達比較，差異均有統計學意義（F=16.345、50.373、6.217，P<0.05）；兩兩比較結果顯示，每組數據與前一組進行對比，在開髓3 d組與空白組比較，AIM2和caspase-1基因表達量差異有統計學意義（F=1 178.910、81.224，P<0.01、0.05），IL-1β基因的表達量在開髓5 d組有顯著升高（F=164.414，P<0.05），并且在7 d后顯著下降（F=18.786，P<0.05）。見表2。

3討論

哺乳動物的天然免疫系統是機體受到外來微生物侵害后啟動的第一道防線[3-4]。免疫細胞對感染的病原微生物及其產物的識別主要是依賴于細胞質內存在的一類被稱為“炎癥體”的多蛋白復合物[5-8]，該蛋白復合物為炎癥反應的啟動者，能夠感受外界信號刺激，激活caspase-1（半胱天冬酶-1），調控IL-1β、IL-18和IL-33的成熟和分泌，從而引發炎癥反應[5，9-12]。炎癥體是caspase活化所必需的反應平臺，能夠識別病原體相關分子模式[13-15]，這是一種不同于宿主自身正常細胞的保守分子結構，它可以識別自身物質（例如宿主蛋白）和非自身物質（例如微生物），可以感知像病原微生物或細胞應激等“危險信號”的存在并做出反應，而對自身或共生菌的無害分子沒有影響。AIM2是一種炎癥體，通過識別細胞質雙鏈DNA與凋亡相關點狀蛋白結合，激活下游的caspase-1，促進IL-1β的合成及分泌，而IL-1β是一種針對感染、損傷和炎癥刺激最有利的促炎因子之一[11，16-18]。

AIM2炎癥體在腫瘤和自身免疫性疾病中的作用已經得到了廣泛的認同，但其在牙髓炎癥反應中的作用尚未完全確定。近年來，AIM2炎癥體的體外研究取得了一些進展，而體內研究尤其是牙髓組織中的研究還很少。與體外實驗相比，體內試驗更接近生物體內實際條件，對后續深入研究以及臨床轉化更具有參考價值。因此，為了研究AIM2炎癥體在牙髓炎癥中的作用，我們采用大鼠上頜磨牙單純開髓誘導的牙髓炎模型，該方法相對簡單實用，且通過設置開髓深度具有較強的條件可控性。

本文HE染色結果顯示，開髓3 d后大鼠牙髓組織中有炎性細胞浸潤，發生了明顯的炎癥反應，隨著牙髓開放時間的延長，牙髓炎癥反應程度逐漸加重，并在開髓7 d后出現牙髓壞死。免疫熒光染色結果顯示，在健康的大鼠牙髓組織中，AIM2主要表達于成牙本質細胞層，在牙髓細胞層中僅有少量的表達；而在開髓后的大鼠牙髓細胞層中AIM2的表達量有明顯的增多。因此，我們認為在大鼠牙髓組織中存在AIM2，并且隨著牙髓開放時間的延長，AIM2的表達量尤其是牙髓細胞層中有顯著的升高，預示著AIM2的表達與牙髓的炎癥反應有一定的聯系。至此，我們證實了牙髓組織中AIM2炎癥體的表達并且其表達量與炎癥呈正相關。

本文RT-PCR檢測結果顯示，牙髓組織開髓的早期，AIM2、caspase-1和IL-1β基因表達水平均有上升的趨勢，表明AIM2在大鼠牙髓組織中的表達量增加與牙髓炎癥反應的程度有著密切的聯系，并且AIM2和caspase-1表達顯著上調的時間節點要早于IL-1β，而且上調的趨勢更為顯著。因此，我們推測AIM2在大鼠牙髓炎的發生、發展中起到了正調節作用。后期隨著牙髓組織的壞死其表達量出現了下降的趨勢，我們認為可能是由于組織壞死引起的細胞量減少繼而導致AIM2表達量的下降。同時，AIM2炎癥體對細胞凋亡可能也有一定的調控作用，這一點還有待進一步研究證實。

本文研究AIM2炎癥體在大鼠牙髓組織中的表達，結果顯示，在基因水平上其表達量與炎癥反應呈正相關；對其下游因子的檢測結果顯示，促炎細胞因子IL-1β的表達量變化發生時間要晚于AIM2，我們認為AIM2能夠在大鼠牙髓組織中對IL-1β的表達起到正調節作用，即AIM2在大鼠牙髓炎發生發展中起到了重要的促進作用。此外，AIM2炎癥體表達量的上調出現的非常早，在開髓3 d即出現了顯著的上升，提示AIM2可能在大鼠牙髓炎癥的早期或急性期發揮重要作用。開髓7～10 d，AIM2炎癥體的表達量出現了小幅度的上升，而HE染色顯示這一時間段內牙髓組織開始出現壞死。我們推測除了炎癥反應以外，AIM2炎癥體可能與牙髓組織的壞死有著密切的聯系。當然，這些結論尚需進一步的研究證實。

牙髓炎一直是困擾臨床醫生的一個難題[19-20]，就目前的診療方式而言，根管治療是治療牙髓炎癥，尤其是不可逆炎癥的首選方法[21-25]。但是，在治療過程中清除的牙髓組織難以再生，而缺少牙髓組織營養供給的牙本質因其有機物的降解而增加了其脆性，導致術后容易發生冠根折[26-32]，最終引起牙齒的缺失[33]。而對于炎癥反應的早期干預是否能夠有效地降低不可逆性牙髓炎的發生尚不確定[34]。本研究證實了牙髓組織中存在AIM2炎癥信號通路，這將會為后期尋找牙髓炎癥上游的調控靶點提供研究基礎，也可為后期臨床牙髓炎的早期干預提供理論依據。

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（本文編輯牛兆山）