咪達唑侖通過調節Nrf2/HO-1 信號通路對宮頸癌細胞鐵死亡的作用及機制研究

張鵬 葛亮 孔令國 韓旭東

甘肅省婦幼保健院（甘肅省中心醫院）麻醉科（蘭州 730050）

宮頸癌是常見的婦科癌癥之一，發病率和病死率極高。雖然手術、化療、放療等治療方法已在臨床得到應用，但預后并不令人滿意，總生存率仍較低［1］。因此，迫切需要探索新的治療靶點和療法。研究表明，靶向鐵死亡可能是治療宮頸癌的一種可行策略［2］。鐵死亡是一種鐵依賴的脂質過氧化物積累達到致死水平的細胞死亡調控形式［3］。核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是調控鐵死亡的關鍵通路之一，該通路激活后可抑制脂質過氧化反應，保護細胞免受鐵死亡［4］。咪達唑侖是一種吸收迅速、短效的苯二氮類衍生物，臨床中被廣泛用作鎮靜、催眠藥［5］。近年來，有研究發現咪達唑侖可影響肝細胞癌［6］、肺癌［7］、乳腺癌［8］、神經膠質瘤［9］等多種腫瘤的發展，是一種潛在抗癌藥物。然而，但咪達唑侖在宮頸癌中的作用以及是否影響鐵死亡的發生仍鮮見報道。本研究旨在通過體外培養人宮頸癌HeLa 細胞，觀察咪達唑侖對HeLa 細胞鐵死亡的影響，并探究調節Nrf2/HO-1 信號通路作為其分子機制的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 HeLa細胞（貨號4613210，上海奧陸生物科技公司）；咪達唑侖（批號20210509，江蘇恩華藥業公司）；Nrf2 激活劑Bardoxolone（貨號HY-14909，Med Chem Express 公司）；CCK-8 試劑、0.1%結晶紫染液（貨號CA1210、G5500，北京Solarbio 公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）（貨號P4170，上海玉博生物科技公司）；醋酸鈾（貨號ZCA-JPH534，上海甄準生物科技公司）；檸檬酸鉛（貨號0002，武漢普洛夫生物科技公司）；鐵檢測試劑盒（貨號ab83366，Abcam 公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（貨號S0033S、S0052、S0131S，上海Beyotime 公司）；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、兔源一抗anti-GAPDH、山羊抗兔二抗（貨號WLA016a、WLA004a、WL01114、WLA023，沈陽Wanleibio 公司）；兔源一抗anti-Nrf2、anti-HO-1、anti-GSH 過氧化物酶4（GSH peroxidase 4，GPX4）、Lamin B1（貨號ab62352、ab68477、ab125066、ab133741，Abcam 公司）。

1.2 細胞培養 HeLa 細胞采用DMEM 培養基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗），培養于37 ℃、5% CO2培養箱中，待細胞密度達90%時收集。

1.3 CCK-8 實驗、克隆形成實驗檢測各組HeLa細胞增殖情況

1.3.1 CCK-8實驗 將HeLa細胞以5×103個/孔接種至96 孔板中，待貼壁后將其分為L-咪達唑侖組/M-咪達唑侖組/H-咪達唑侖組（5、10、20 μmol/L 咪達唑侖）［8］、H-咪達唑侖+Nrf2 激活劑組（20 μmol/L咪達唑侖+80 nmol/L Bardoxolone［10］），另設置正常培養的對照（Control）組，繼續培養24 h。隨后加入CCK-8 溶液，繼續孵育2 h，通過SKSW-KC 酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度（OD）。細胞活力與OD450值呈正比。

1.3.2 克隆形成實驗 將HeLa 細胞以1 × 103個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同上。繼續培養24 h 后置于4%多聚甲醛中固定20 min，而后置于0.1%結晶紫中染色10 min，于顯微鏡下計數≥50 個細胞的克隆數。

1.4 PI 染色檢測各組HeLa 細胞死亡率 將HeLa細胞以1 × 106個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續培養24 h 后收集細胞，并轉移至流式管中，加入5 μL PI，4 ℃孵育5 min，通過BD FACSCanto Ⅱ流式細胞儀測定細胞死亡率。

1.5 透射電鏡觀察各組HeLa 細胞線粒體形態變化 將HeLa細胞以1×106個/孔接種至6孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續培養24 h 后收集細胞，加入2.5%戊二醛4 ℃固定過夜，次日PBS 清洗后加入1%鋨酸固定2 h，乙醇梯度脫水后進行環氧樹脂包埋、超薄切片（60～80 nm），最后醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色15 min，通過H-7650 透射電鏡捕獲圖像。

1.6 檢測各組HeLa 細胞中鐵、ROS、GSH、MDA水平 將HeLa 細胞以1 × 106個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續培養24 h 后收集細胞，利用鐵、ROS、GSH、MDA 檢測試劑盒分別檢測細胞裂解液中的鐵、ROS、GSH、MDA 水平。

1.7 Western blot檢測各組HeLa細胞中Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白及GPX4蛋白表達情況 將HeLa細胞以1 × 106個/孔接種至6 孔板中，待貼壁后分組處理同1.3。繼續培養24 h 后收集細胞，利用RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA 法測定濃度后進行定量、變性處理，隨后進行凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉，孵育兔源一抗anti-Nrf2、anti-HO-1、anti-GPX4、Lamin B、anti-GAPDH（4 ℃過夜），次日室溫孵育山羊抗兔二抗2 h，滴加ECL 發光液后置于Tan5200 凝膠成像分析系統中拍照，借助Image J軟件進行灰度分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 25.0進行統計學分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較行One-way ANOVA 分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組HeLa 細胞增殖情況 與Control 組比較，L-咪達唑侖組、M-咪達唑侖組、H-咪達唑侖組HeLa細胞活力下降，克隆數減少，且H-咪達唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達唑侖組比較，H-咪達唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細胞活力升高，克隆數增加（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 各組HeLa 細胞增殖情況Tab.1 Proliferation of HeLa cells in each group ±s

表1 各組HeLa 細胞增殖情況Tab.1 Proliferation of HeLa cells in each group ±s

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control組L-咪達唑侖組M-咪達唑侖組H-咪達唑侖組H-咪達唑侖+Nrf2激活劑組F值P值n4 4 4 4 4細胞活力（OD450值）1.54±0.15 1.27±0.12*0.94±0.11*#0.61±0.08*#△0.97±0.12▲35.768＜0.001克隆數（個）132.45±10.93 107.28±9.41*81.45±6.52*#52.61±4.39*#△76.18±6.15▲61.159＜0.001

圖1 克隆形成實驗檢測HeLa 細胞克隆數Fig.1 Clonal formation experiment to detect the number of HeLa cell clones

2.2 各組HeLa 細胞死亡率 與Control 組比較，L-咪達唑侖組、M-咪達唑侖組、H-咪達唑侖組HeLa細胞死亡率增加，且H-咪達唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達唑侖組比較，H-咪達唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細胞死亡率減少（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 各組HeLa 細胞死亡率Tab.2 HeLa cell mortality in each group ±s，%

表2 各組HeLa 細胞死亡率Tab.2 HeLa cell mortality in each group ±s，%

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control 組L-咪達唑侖組M-咪達唑侖組H-咪達唑侖組H-咪達唑侖+Nrf2 激活劑組F 值P 值n4 4 4 4 4死亡率9.16 ± 1.03 15.89 ± 2.15*26.53 ± 2.94*#39.46 ± 3.12*#△23.18 ± 2.57▲85.664＜0.001

2.3 各組HeLa 細胞線粒體形態變化 Control 組HeLa 細胞線粒體形態正常，經L-咪達唑侖組、M-咪達唑侖、H-咪達唑侖處理后，線粒體呈現顯著的鐵死亡特征，體積縮小，膜密度增加，嵴減少，且H-咪達唑侖組變化更明顯；而在H-咪達唑侖處理的同時增加Nrf2 激活劑處理，線粒體鐵死亡損傷程度減輕。見圖3。

圖3 透射電鏡觀察HeLa 細胞線粒體形態變化（× 15 000）Fig.3 Morphological changes of mitochondria in HeLa cells observed by transmission electron microscopy（× 15 000）

2.4 各組HeLa 細胞中鐵、ROS、GSH、MDA 水平及GPX4 蛋白表達情況 與Control 組比較，L-咪達唑侖組、M-咪達唑侖組、H-咪達唑侖組HeLa 細胞中鐵、ROS、MDA 水平升高，GSH 水平及GPX4 蛋白表達下降，且H-咪達唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達唑侖組比較，H-咪達唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細胞中鐵、ROS、MDA 水平下降，GSH 水平及GPX4 蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖4、表3。

表3 各組HeLa 細胞中鐵、ROS、GSH、MDA 水平及GPX4 蛋白表達情況Tab.3 The levels of iron，ROS，GSH，MDA，and GPX4 protein expression in HeLa cells in each group ±s

表3 各組HeLa 細胞中鐵、ROS、GSH、MDA 水平及GPX4 蛋白表達情況Tab.3 The levels of iron，ROS，GSH，MDA，and GPX4 protein expression in HeLa cells in each group ±s

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control 組L-咪達唑侖組M-咪達唑侖組H-咪達唑侖組H-咪達唑侖+Nrf2 激活劑組F 值P 值n4 4 4 4 4鐵（nmol/mg）0.46 ± 0.08 0.81 ± 0.10*1.52 ± 0.13*#2.14 ± 0.21*#△1.39 ± 0.15▲85.151＜0.001 ROS（%Control）1.05 ± 0.12 1.53 ± 0.16*2.18 ± 0.21*#2.93 ± 0.27*#△1.86 ± 0.19▲51.782＜0.001 GSH（nmol/mg）1.79 ± 0.16 1.45 ± 0.12*1.18 ± 0.10*#0.78 ± 0.09*#△1.06 ± 0.11▲42.271＜0.001 MDA（nmol/mg）7.15 ± 1.02 10.86 ± 1.23*14.31 ± 1.62*#18.06 ± 2.08*#△13.29 ± 1.71▲26.493＜0.001 GPX4/GAPDH 0.94 ± 0.09 0.78 ± 0.07*0.59 ± 0.07*#0.31 ± 0.04*#△0.53 ± 0.06▲50.346＜0.001

圖4 Western blot 檢測HeLa 細胞中GPX4 蛋白表達情況Fig.4 Western blot detection of GPX4 protein expression in HeLa cells

2.5 各組HeLa 細胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關蛋白表達情況 與Control 組比較，L-咪達唑侖組、M-咪達唑侖組、H-咪達唑侖組HeLa 細胞中核Nrf2、HO-1 蛋白表達下降，且H-咪達唑侖組變化更明顯（P＜0.05）；與H-咪達唑侖組比較，H-咪達唑侖+Nrf2 激活劑組HeLa 細胞中核Nrf2、HO-1 蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖5、表4。

表4 各組HeLa 細胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關蛋白表達情況Tab.4 Expression of Nrf2/HO-1 signal pathway related proteins in HeLa cells of each group ±s

表4 各組HeLa 細胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關蛋白表達情況Tab.4 Expression of Nrf2/HO-1 signal pathway related proteins in HeLa cells of each group ±s

注：與Control 組比較，*P ＜0.05；與L-咪達唑侖組比較，#P ＜0.05；與M-咪達唑侖組比較，△P ＜0.05；與H-咪達唑侖組比較，▲P ＜0.05

組別Control組L-咪達唑侖組M-咪達唑侖組H-咪達唑侖組H-咪達唑侖+Nrf2激活劑組F值P值例數4 4 4 4 4核Nrf2/Nrf2 0.61±0.07 0.50±0.05*0.37±0.03*#0.22±0.03*#△0.34±0.04▲41.982＜0.001 HO-1/GAPDH 1.13±0.12 0.94±0.08*0.71±0.06*#0.45±0.05*#△0.67±0.06▲44.918＜0.001

圖5 Western blot 檢測HeLa 細胞中Nrf2/HO-1 信號通路相關蛋白表達情況Fig.5 Western blot detection of Nrf2/HO-1 signal pathway related protein expression in HeLa cells

3 討論

宮頸癌是全球發病率和病死率極高的惡性腫瘤類型［11-12］。宮頸癌的主要治療策略是手術和化療，但化療易產生耐藥性，轉移和復發率仍較高，預后不理想［13］。因此，迫切需要尋找新的機制或治療方案。

近年來，靶向鐵死亡已成為癌癥治療的熱門研究領域［14-15］。鐵死亡為一種鐵依賴的脂質過氧化物積累引發的細胞死亡形式，伴有特征性的形態學變化，包括線粒體皺縮，膜密度增加，嵴數量減少或消失，生化表現主要有ROS 堆積，毒性脂質過氧化產物MDA 大量產生［16-17］。GPX4 是一種抗鐵死亡介質，GPX4 可催化還原型GSH 生成氧化型GSH，而在此過程中，毒性脂質過氧化物被還原為反應性較低的羥基化合物，也就是說，GPX4 可通過將GSH 作為底物終止鐵死亡的發生，故鐵死亡的生化表現亦伴隨GPX4、GSH 的耗竭［18］。目前，咪達唑侖已被證實具有潛在的抗腫瘤作用，例如，QI 等［6］發現咪達唑侖可通過上調miR-124-3p 抑制肝細胞癌細胞增殖，促進細胞凋亡；LU 等［8］發現咪達唑侖可通過抑制細胞增殖和上皮間充質轉化對肺癌和乳腺癌發揮抗癌作用。此外，有報道稱咪達唑侖在婦科腫瘤（包括宮頸癌）患者的手術中具有較好的鎮靜作用［19-20］。但咪達唑侖在宮頸癌中的作用及鐵死亡是否參與目前尚不清楚。本研究發現HeLa 細胞經L-咪達唑侖、M-咪達唑侖、H-咪達唑侖處理后，細胞活力下降，克隆數減少，死亡率升高，表明咪達唑侖可抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞死亡，具有抗宮頸癌作用。同時，本研究發現，咪達唑侖在抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞死亡時伴隨著顯著的鐵死亡形態學特征和生化表現，即鐵、ROS、MDA 水平升高，GSH、GPX4 水平下降，且存在劑量效應關系，表明咪達唑侖不僅能夠抑制HeLa 細胞增殖，還可誘導其鐵死亡，高劑量效果更佳。

Nrf2 是抗氧化系統的主要調節因子，正常條件下，Nrf2 錨定于胞質中，而在氧化條件下Nrf2 易位進入細胞核，啟動HO-1 抗氧化基因轉錄，調節鐵代謝、脂質代謝和谷胱肽合成等過程，保護細胞免受鐵死亡［21-22］。研究顯示，抑制Nrf2/HO-1 通路是誘導癌細胞鐵死亡的重要靶點［23-24］。高薇等［25］發現，鴉膽子苦醇可通過抑制Nrf2/HO-1 通路，誘導胃癌HGC-27 細胞鐵死亡，進而抑制細胞增殖。為了探究咪達唑侖誘導HeLa 細胞鐵死亡是否與抑制Nrf2/HO-1 信號通路有關，我們首先檢測了經L-咪達唑侖、M-咪達唑侖、H-咪達唑侖處理后HeLa 細胞中核Nrf2、HO-1 蛋白表達變化，結果發現，二者表達均下調，且經H-咪達唑侖處理后下調更明顯。然后我們在H-咪達唑侖處理的基礎上增加Nrf2 激活劑處理，結果發現，咪達唑侖誘導HeLa 細胞鐵死亡的作用被減弱。這兩部分結果共同表明咪達唑侖誘導HeLa 細胞鐵死亡與抑制Nrf2/HO-1 信號通路有關。

綜上所述，咪達唑侖能以劑量依賴性方式抑制HeLa 細胞增殖，誘導其鐵死亡，可能通過抑制Nrf2/HO-1 信號通路而實現。本研究可望為咪達唑侖的抗癌應用提供一定的理論依據。

【Author contributions】ZHANG Peng performed the experiments and wrote the article.HAN Xudong performed the experiments.GE Liang revised the article.KONG Lingguo designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.