基于BSA重測序的辣椒CMS恢復基因連鎖分子標記開發

王萌 趙虎 徐曉美 潘堯鏵 趙曾菁 吳星 王日升

關鍵詞：辣椒；全基因組重測序；胞質雄性不育；恢復基因；分子標記

辣椒（Capsicumspp.）是世界最大的調味料作物和世界第三大蔬菜作物，也是我國種植面積最大、加工方式最多、消費功能最多的蔬菜和最大的調味品[1]。目前辣椒雜交制種生產仍較多采用人工去雄，種子生產成本高，與國外品種相比缺乏市場競爭力[2]。利用辣椒胞質雄性不育（CMS）進行三系雜交制種不僅可以確保雜交種子純度，更有利于保護品種的知識產權，是辣椒育種發展的主要趨勢[3]。開發與辣椒CMS恢復基因緊密連鎖的分子標記，大規模對自交系及中間材料進行恢復基因篩選，可大大提高三系育種效率。

辣椒CMS育性恢復的遺傳控制多樣且復雜，多數研究者認為辣椒Rf基因由1個顯性基因控制的[4-5]，WEI等[6]認為辣椒CMS恢復基因（Rf）是受2個主加性－顯性上位基因和1個加性-顯性多基因控制，也有認為辣椒CMS育性恢復與1個主QTL和4個小QTL有關[7]。針對辣椒Rf基因，前人已經開發了多種類型的分子標記用于輔助育種，這些標記包括隨機擴增多態性（RAPD）標記[8]、簡單重復序列（SSR）標記[9]、插入/缺失（InDel）標記[10]、切割擴增多態性序列（CAPS）標記[11]、序列特征擴增區（SCAR）標記[12]和競爭性等位基因特異性PCR（KASP）標記[6，13]等。其中應用最廣泛的標記CRF-SCAR[12，14]在不同自然群體中對育性恢復性狀的準確率最高，同一標記在不同群體間準確率差異較大，準確率較高的報道有89.1%[4]、79.2%[15]和100%[16]。這些結果進一步說明，辣椒基因組包含多個候選Rf基因，不同恢復系可能具有基因型特異性的Rf基因[11，15，17-18]，目前尚無通用標記，特異的恢復基因需要開發相應的標記才更有效。

目前，最廣泛使用的CRF-SCAR標記[15，17]不能區分本單位的不育系014A和恢復系014C，說明恢復系014C可能具有不同Rf基因，需要開發相應的連鎖標記。深度測序結合BSA法，在不構建遺傳圖譜的情況下，可快速定位正向遺傳學的性狀位點[19]，快速篩選目標基因以獲得緊密連鎖分子標記[20]，目前已用于多種作物質量性狀或主效基因的定位，如尹明智等[21]利用該方法定位了油菜野芥胞質雄性不育恢復基因；LI等[22]利用BSA法結合基因組測序和轉錄組測序，聯合分析獲得了大白菜中與葉狀頭形成相關的共同候選基因。本研究以不育系014A和恢復系014C構建了F2分離群體，利用BSA法結合全基因組重測序，獲得辣椒CMS恢復基因相關定位區間，根據區間內的差異SNP/InDel設計引物，篩選恢復基因連鎖分子標記，為加速選育辣椒CMS恢復系奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

以不育系014A×恢復系014C構建F2分離群體，正常田間管理，于花期調查育性，構建測序所需基因可育混池和不育混池，可育混池單株分別隔離，單株留種，每個單株種植30個子代，調查育性分離情況，判斷可育混池內單株基因型為RfRf或Rfrf。試驗材料種植于廣西農業科學院基地。

1.2方法

1.2.1育性調查2020年對F2群體1008個單株進行插牌編號，田間正常管理，于辣椒開花期開展3次以上育性調查并記錄，參考花粉指數（PI）法：根據肉眼觀察花粉數量分為1～4級，每株調查10朵花，在開花當天進行觀察。1級：花藥上布滿花粉，同可育親本無明顯差異；2級：有花粉，但不及可育親本的一半，花粉量明顯減少；3級：有很少量的花粉；4級：花藥干癟皺縮，無可見的花粉。對于不易判定等級的調查的單株，采用多次調查的方法，同時調查自然坐果率和果內種子數量進行輔助判斷并記錄。

1.2.2建池、測序與數據處理在F2群體采集單株葉片提取DNA，同時分別選擇1級和4級各30個單株，分別取幼嫩葉片0.1g用于DNA的提取，DNA分別等量混合構建不育基因池和可育基因池。2個混池連同親本建庫后使用HiseqX10PE150上機測序，測序深度為30×。樣本由廣州基迪奧生物科技有限公司完成建庫和測序。測序得到的原始數據先進行過濾，獲得cleanreads，再利用Burrows-WheelerAligner（BWA，v0.7.16a-r1181）將過濾后的reads與辣椒參考基因組Ensembl_release47（http：//plants.ensembl.org/Capsicum_annuum/Info/Index）進行比對。比對結果使用GATK（v3.5）VariantFiltration模塊對SNP和InDel進行變異檢測。

1.2.3基于SNP-index的BSA分析與Fisher精確檢驗對辣椒育性連鎖定位區間進行篩選時，首先過濾不育和可育混池中SNP-index均小于0.3或大于0.7的位點，計算各混池的SNP-index和混池間的Δ（SNP-index），然后以滑動窗口法對Δ（SNP-index）在各個染色體上的分布制圖。置信區間設置為95%和99%，取正向置信水平99%以上窗口作為候選區間[23]。

采用Fisher精確檢驗法（SPSS21.0）對2個混池中的等位基因深度比例進行檢驗，顯著性使用P值表示，再次按照滑窗的方法對計算獲得的P值結果進行擬合，取P值的-log10后繪制曼哈頓圖。原始的P值進行FDR校正后獲得q值，篩選q值小于閾值（0.05）的位點作為顯著位點，連續的顯著位點合并成一個區間，獲得顯著區間。

1.2.4DNA提取與引物篩選采用改良的CTAB法提取親本及F2群體所有單株DNA，檢測合格后將濃度統一調整至50ng/μL用于后續試驗。根據定位區間獲得的基因、InDel/SNPs信息，結合前人報道恢復基因類型信息，每個基因至少設計1對以上的引物，優先選擇位于外顯子區域的SNP和多態性差異5bp以上的InDel作為第一輪SSR/InDel分子標記，篩選在親本間呈現多態性的引物。在第一輪多態性引物附近，第二輪根據基因信息和InDel/SNPs設計更多的標記，再次利用雙親進行標記篩選，然后結合F2、F3育性田間調查結果，利用確定了基因型的30個可育混池單株（基因型為RfRf或Rfrf）、30個不育混池單株（基因型為rfrf）進行篩選，獲得準確率最高的分子標記，最后使用F2群體進行準確率驗證。

提取目標位點兩翼各150bp的堿基序列，使用Oligo6軟件進行引物設計。引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應總體系均為10μL，其中50ng/μL模版DNA1μL，TaqDNA聚合酶5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH2O3μL。PCR擴增程序參照王日勇等[24]的方法。擴增產物用8%變性聚丙烯酰胺凝膠110V電泳分離95min，用銀染法進行顯影；根據標記特征，分離群體內驗證也可使用2%瓊脂糖，電壓120V，電泳35min；觀察結果并拍照保存。

2結果與分析

2.1F2代分離群體育性調查

通過不育系014A和恢復系014C雜交構建的F2代分離群體1008個單株育性調查結果表明，花粉正?？捎龁沃隇?85株，不育的單株為223株，可育、不育分離比例均接近3∶1，按1對基因的控制模式分別進行χ2測驗，χ2值為1.341，P值為0.247，P>0.05，符合理論預測，即可育和不育分離比符合3∶1的分離規律（表1），表明辣椒CMS育性恢復性狀受1對顯性基因控制。30個測序用的極端可育單株通過種植調查F3群體分離情況，育性不發生分離則親本為純合可育（RfRf），育性發生分離則親本為雜合可育（Rfrf），連同30個純合不育單株（rfrf）用于后續分子標記篩選與驗證。

2.2重測序混池數據質量評估

根據親本和混池重測序的相關數據結果顯示（表2），此次測序共得到450.60Gb原始數據，經數據質控過濾后獲得448.27Gb高質量有效數據。樣品的GC堿基含量為36.08%～36.84%，測序質量控制標準Q30>93.75%。不育、可育測試樣品與參考基因組的比對率分別為97.84%、97.67%?；蚪M覆蓋度20×比例約為80%以上。全基因組范圍內分別檢測到950253個InDel和15142397個SNP。由此可知，本研究樣本數據量足夠，GC分布正常，測序質量合格，測序數據與參考基因組比對結果正常，覆蓋度飽和，可用于后續的變異分析及目標性狀的基因定位。

2.3與辣椒CMS育性關聯的連鎖區間定位

基于SNP-index的BSA分析結果顯示，正向置信水平99%以上窗口有12個區間分別位于6號、8號、11號染色體上（表3，圖1）。由圖1可知，6號染色體定位區間峰值高、峰形寬大，8號染色體存在多個小峰，11號染色體也存在一個峰值高的狹窄峰。由表3可知，6號染色體的第一個定位區間最大，長度為26.72Mb，約占總區間長度32%，其中包含540個基因，約占基因總數的64%，基因分布相對集中。

為進一步縮小定位區間，采用Fisher精確檢驗法對2個混池中的等位基因深度比例進行檢驗，得到基于-log10（p）值的全基因組分布曼哈頓圖（圖2），獲得的定位區間為6號染色體1.44～8.28Mb，該區間內包含4441個SNP、266個Indel和227個基因。

2.4分子標記開發

根據6號染色體1.44～8.28Mb候選區間內227個基因及SNP/InDel位點，共設計了316對引物，擴增親本，篩選出27對在親本間差異顯著的標記。根據基因注釋獲得的3個恢復基因候選基因，然后重點在這3個基因附近設計引物并篩選，最終獲得了能穩定擴增出特異條帶的標記OP59和PP5。OP59引物序列為F：5-TGGAACAGAGTCATATTTTTCTTTCAT-3、R：5-CCAATTCCGATAAAGGGTTTT-3。PP5引物序列為F：5-TCATTCTTTAGGGGAAGCTTAGG-3、R：5-CGGTGTGGACAGACATTTCA-3。根據SNP位點設計的標記OP59，在純合可育材料可擴增出282bp條帶，不育材料可擴增出278bp條帶，雜合單株能擴增出2條帶（圖3）。根據InDel位點設計的標記PP5，在不育親本、F2雜合可育單株、不育單株中均可擴增出約300bp的條帶，而純合可育親本和F2純合可育單株中無擴增條帶，該標記可使用瓊脂糖電泳更方便快速（圖4）。2個標記在極端群體驗證中準確率均達到100%。

將這2個標記在F2代分離群體隨機挑選的456個單株進行驗證，結果表明，2個標記在重測序的極端群體中準確率均達到100%。共顯性標記OP59在不育的群體中準確率為100%，在可育單株中準確率為97.21%。標記PP5在不育單株和純合可育單株中準確率均為100%。根據與參考基因組比對結果，標記OP59根據位于6號染色體3877192bp處SNP位點設計，參考堿基為A，突變堿基為G，該位點位于恢復基因候選PPR基因T459-15819基因間區，距離為17232bp；標記PP5根據位于6號染色體3897138bp處InDel位點設計，參考堿基為G，突變堿基為GT，該位點位于該基因下游318bp。

3討論

本研究表明，辣椒CMS核內恢復基因經BSA結合法結合全基因組重測序，比對參考基因組Ensembl_release47，經Fisher精確檢驗，定位在6號染色體頂端1.44～8.28Mb區間，區間長度6.84Mb。WEI等[6]通過基于轉錄組測序的BSR-seq方法，通過與參考基因組Zunla-1比對，將恢復基因定位在6號染色體末端16.8Mb的區間，其使用的試驗材料包含的恢復基因被認為是受2個主加性-顯性上位基因和一個加性-顯性多基因控制。ZHANG等[25]也是使用BSA結合基因組重測序的方法在6號染色體的兩端分別獲得了一個恢復基因，該材料中辣椒CMS育性恢復同時受2對基因控制。本研究所使用的試驗材料F2群體中可育∶不育符合3∶1，因此育性恢復受1對基因控制，這與WEI等[6]、ZHANG等[25]的試驗材料不同，推測確實含有不同的恢復基因。

在許多農作物中多個雄性不育恢復基因（Rf）已經被鑒定，大多數恢復基因屬于PPR基因（編碼蛋白含有五肽重復序列），如水稻[26]、油菜[27]、棉花[28]等。在辣椒作物上，前人報道的恢復基因有PPR6[11]、PPR46[11]、NEDD8[18]、長鏈非編碼RNA[29]等。尹明智等[21]通過對基因定位的候選區域進行序列分析和基因注釋，發現其中的PPR基因，再進行基因克隆及功能驗證，這將是分析恢復基因的一種有效手段。本研究初步獲得的候選基因T459-15819也是屬于PPR基因，該基因是否為調控辣椒育性恢復的關鍵基因，以及如何影響育性的恢復還需進一步分析驗證。

本研究獲得的標記OP59屬于共顯性標記，不僅能夠區分基因純合可育（RfRf）植株和不育（rfrf）植株，還能鑒定出雜合可育（Rfrf）的植株，且準確率高，聚丙烯酰胺凝膠電泳即可分辨，在實際應用中非常簡便有效。標記PP5瓊脂糖凝膠電泳檢測即可，實際應用中可先用PP5檢出純合可育株，然后再用OP59檢出其他類型。

本研究構建的F2群體中，根據花粉指數法將單株劃分為不同的等級，花粉量減少的2、3、4等級全部歸為不育，經χ2測驗，可育和不育分離比符合3∶1，推測辣椒CMS育性恢復性狀受1對顯性基因控制，這與多數研究結果一致[4-5，9，14]。從本研究不育群體實際調查數據來看，單株間花粉量存在一定的差異，因此，本研究使用的恢復基因除受1對顯性基因控制外，在6號、8號、11號染色體上也可能存在育性修飾的微效基因，或基因表達受到環境影響，仍需進一步研究。