嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲致病力的時間效應及對血淋巴的影響

呂朝軍, 張楚毓, 鐘寶珠, 趙建超, 陳 拓

中國熱帶農業科學院椰子研究所,海南 文昌 571339

紅棕象甲Rhynchophorusferrugineus(Oliv.)是棕櫚科植物的重要害蟲,對椰子CocosnuciferaL. (Chakravarthyetal.,2014; Lizanneetal.2016)、油棕ElaeisguineensisJacq. (Nazmietal.,2020)、椰棗PhoenixdactyliferaL.(Manzooretal.,2022)等造成了極為嚴重的損失。隨著人們對食品健康、生態保護的要求越來越高,生物防治作為重要的防控手段日益受到重視。紅棕象甲的生防因子包括綠僵菌(Ahmedetal.,2022)、白僵菌(Ahmed &Freed,2021)、細菌(Almasoudietal.,2022; Celietal.,2022)、昆蟲病原線蟲(Aqsa,2020; Wanetal.,2021; Yasinetal.,2021)等。目前,昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes, EPNs)在農業害蟲防治中越來越表現出其優越性,由于其喜歡潮濕隱蔽的環境,常被用于防治鉆蛀害蟲和土壤害蟲(劉奇志等,2002)。研究發現,在沙特將EPNs施用到土壤中后,可導致60%和46%的紅棕象甲幼蟲和成蟲死亡(Saleh &Alheji,2003);在實驗室條件下處理8 d后,嗜菌異小桿線蟲HeterorhabditisbacteriophoraPoinar對紅棕象甲致死率達到86.9%(Manzooretal.,2017);EPNs功效評估結果顯示,在阿聯酋的椰棗園本土分離的異小桿線蟲能在短時間內成功殺死紅棕象甲的幼蟲、成蟲和繭,椰棗地的RPW種群也成功減少(Elawadetal.,2007)。由于其對昆蟲宿主的高致病性(Gozeletal.,2015),2種常見的EPNs被用作害蟲綜合治理中的生物控制劑(Griffin,2012)。鐘寶珠等(2020a,2020b)研究表明,嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲具有一定的防控潛力,但其對紅棕象甲的血淋巴等免疫系統的影響還未可知。因此,本試驗系統研究了嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲各蟲態的動態毒力水平,及對幼蟲血淋巴總量、血淋巴酯酶活性及血淋巴蛋白含量的影響,以期為揭示嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染紅棕象甲的作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗜菌異小桿線蟲H06品系及紅棕象甲各蟲態均由中國熱帶農業科學院椰子研究所生物防治實驗室自繁自養。其中,嗜菌異小桿線蟲H06品系以大蠟螟Galleriamellonella(L.)幼蟲為寄主進行擴繁,采用White (1927)方法收集3齡感染期線蟲(infective juveniles, IJs),使用前用蒸餾水稀釋至系列濃度備用;紅棕象甲采用半人工飼料(馬子龍等,2012)進行飼養。

試蟲繁育及毒力試驗均在溫度(26±1) ℃、濕度(70±5)%的室內開展。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗜菌異小桿線蟲對紅棕象甲不同蟲態致病力的時間效應 8齡幼蟲致病力測定:用移液槍吸取1 mL線蟲溶液,均勻滴加在紅棕象甲背部,將試蟲轉移至養蟲盒(35 cm×24 cm×11 cm)中,養蟲盒內預先放置2層甘蔗段作為試蟲飼料。每處理30頭,重復3次,處理后逐日統計死亡率,連續統計5 d。以昆蟲針輕觸蟲體,完全不動者為死亡。以蒸餾水處理為對照。

卵致病力測定:將卵置于養蟲杯(φ4 cm×3 cm)中,杯底覆蓋濾紙,用移液槍滴加1 mL不同濃度線蟲液至濾紙上。處理后逐日統計卵死亡率,連續統計5 d。每處理30粒,重復3次,以卵變紅色或黑色為死亡。以蒸餾水處理為對照。

蛹致病力測定:將紅棕象甲蛹單獨置于養蟲杯(φ4 cm×3 cm)中,杯底覆蓋濾紙,用移液槍滴加1 mL不同濃度線蟲液至濾紙上。處理后逐日統計蛹死亡率,連續統計7 d。每處理30頭,重復3次,以毛筆輕觸蛹體,蛹不動者為死亡。以蒸餾水處理為對照。

成蟲致病力測定:將紅棕象甲成蟲單獨置于養蟲杯(φ4 cm×3 cm)中,杯內添加甘蔗塊作為試蟲飼料,杯底覆蓋濾紙,用移液槍滴加1 mL不同濃度線蟲液至濾紙上。處理后逐日統計成蟲死亡率,連續統計7 d。每處理30頭,重復3次,以昆蟲針輕觸蟲體蜷曲不動者為死亡。以蒸餾水處理為對照。

1.2.2 紅棕象甲幼蟲血淋巴總量測定 參考胡美英等(2002)的方法。以750條·mL-1嗜菌異小桿線蟲H06品系處理紅棕象甲8齡幼蟲,處理方法同1.2.1。用電子天平準確稱量處理后0、36、48、60和72 h的紅棕象甲8齡幼蟲活蟲質量(精確至0.001 g),用昆蟲針刺破胸部,擠出血淋巴,讓其在吸水紙上爬行0.5 h后再次稱質重,最后計算血淋巴總質量(每克幼蟲體重中血淋巴的毫克數,mg·g-1)。以蒸餾水處理為對照。

1.2.3 紅棕象甲血淋巴酯酶活性測定 采用陳長琨(1993)的方法。以750條·mL-1線蟲液處理紅棕象甲8齡幼蟲,處理方法同1.2.1。在濃度為3×10-4mol·L-1的3 mLα-醋酸萘酯溶液中加入0.04 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)0.45 mL。搖勻后置于25 ℃下平衡5 min,各加入血淋巴0.05 mL,立即搖勻計時。25 ℃下平衡25 min,迅速加入顯色劑0.5 mL (1%固藍RR鹽溶液+15%SDS,使用前2∶5混勻),終止反應并顯色,30 min后待出現穩定的藍綠色后,測定D600 nm值。以蒸餾水處理為對照。

1.2.4 紅棕象甲血淋巴蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍G-250法(陳鈞輝等,2003)。以750條·mL-1線蟲液處理紅棕象甲8齡幼蟲,處理方法同1.2.1。預先用0.5 mg·mL-1牛血清蛋白制作標準曲線。將處理后的紅棕象甲血淋巴溶液0.2 mL加入蒸餾水0.8 mL,考馬斯亮藍試劑5 mL,搖菌放置20 min后,測定D595 nm值,對照標準曲線統計每毫升血淋巴中的蛋白質含量(mg·mL-1)。以蒸餾水處理為對照。

1.3 數據統計

參考黃劍和吳文君(2004)的方法,采用Excel統計軟件求出毒力回歸方程及LC50、LC50的95%置信區間等。

2 結果與分析

2.1 嗜菌異小桿線蟲對紅棕象甲不同蟲態致病力的時間效應

嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態的毒力水平和致死效果如表1和圖1所示。以LC50為參考,隨處理時間延長,嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲各蟲態的毒力水平也呈現上升的趨勢,其中以對卵的毒力水平最高。

圖1 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態的致死率

表1 嗜菌異小桿線蟲H06品系處理對紅棕象甲的毒力

以處理后LC50的95%置信區間是否重疊為參考值,處理后3 d嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲各蟲態的毒力以卵最高,而8齡幼蟲、蛹和成蟲處理組的毒力值未出現顯著差異;處理后4和5 d后,對各蟲態的毒力值仍以卵最高,其次為8齡幼蟲和蛹,對成蟲的毒力水平低于8齡幼蟲處理組,但與蛹處理組差異未達到顯著水平;在處理后期(6和7 d),嗜菌異小桿線蟲H06品系對成蟲的毒力水平均顯著高于蛹處理組。

嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲不同蟲態的致死率結果表明,隨著處理時間的延長,紅棕象甲的死亡率均呈現上升的趨勢(圖1)。

2.2 紅棕象甲幼蟲血淋巴總量的測定

經嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,紅棕象甲血淋巴總量呈現一個前期(0～48 h)升高,后期(48～72 h)逐漸降低的趨勢,其中在處理后48 h的血淋巴總量為83.42 mg·g-1,與對照組相比升高273.75%,在60 h降低至與對照相當水平,處理后72 h的血淋巴總量為18.90 mg·g-1,與對照相比降低39.73%(圖2)。

圖2 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲血淋巴總量的影響

2.3 紅棕象甲幼蟲血淋巴酯酶活性的測定

經嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,紅棕象甲血淋巴酯酶活性短期內(0～36 h)升高,處理后36 h的酯酶活性升高11.11%,之后逐漸下降,處理后60和72 h的血淋巴酯酶活性與對照相比分別降低10.18%和53.36%(圖3)。

圖3 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲血淋巴酯酶活性的影響

2.4 紅棕象甲幼蟲血淋巴蛋白含量的測定

經嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,紅棕象甲幼蟲血淋巴蛋白含量與對照相比呈現下降的趨勢(圖4)。處理后48～60 h呈現一個短暫的回升,之后又迅速下降,其中在處理后72 h,血淋巴的蛋白含量與對照相比下降74.96%。

圖4 嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲幼蟲血淋巴蛋白含量影響

3 討論

昆蟲不同蟲態體內所含營養物質不同,如紫棕象甲Rhynchophorusphoenicis(Fabricius)高齡幼蟲體內蛋白含量達10.51%,而成蟲蛋白含量為8.43%(Omotoso &Adedire,2007)。EPNs侵入蟲體后需取食蟲體內營養物質才可完成增殖進而殺死寄主,寄主的齡期、蟲態及體內激素分泌和免疫調節等均會影響線蟲的寄生效果(劉勇,2020)。本研究中,嗜菌異小桿線蟲H06品系對紅棕象甲卵的毒力水平顯著高于其他蟲態,其次為幼蟲和蛹,而對成蟲的毒力水平最低,這可能與紅棕象甲各蟲態體內的營養物質差異有關。紅棕象甲卵個體較小,僅需較少線蟲個體即可達到對其致死的效果,同時EPNs在寄主體內會釋放共生細菌引起細胞毒性,破壞免疫系統導致寄主死亡(Kaya &Gaugler,1993; Park &Kim,2000),線蟲通過卵孔進入后,不僅取食卵內營養物質,且通過共生細菌破壞卵內細胞的分裂造成卵死亡;幼蟲和蛹體內富含脂肪和蛋白質等營養物質(Khanitthaetal.,2020,2022),雖可為線蟲提供繁殖所需營養,但體內的酯滴和蛋白又是蟲體免疫的重要物質(葛君等,2010),對于緩解線蟲內生細菌對寄主的傷害起到了一定作用。同時,本研究供試的8齡幼蟲和蛹個體相對較大,嗜菌異小桿線蟲H06品系需在蟲體內增殖到一定數量才能對其起到致死效果;而成蟲表皮甲殼致密堅硬且體內營養物質低于其他蟲態,不利于EPNs侵染。

EPNs是昆蟲?；纳蕴鞌?叢斌等,1999),可通過寄主孔口、傷口等部位進入血腔后釋放細菌(Poina &Thomas,1996),使寄主血淋巴表現出明顯的病理學變化(孫昊雨等,2012),損壞寄主的免疫系統并最終導致寄主死亡。昆蟲血淋巴中含有昆蟲生理活性所需的一切代謝物質,對血淋巴成分和功能的干擾必然會影響其正常的代謝功能。在本研究中,經嗜菌異小桿線蟲H06品系處理后,血淋巴總量前期迅速升高,而之后又降低,此趨勢與丁曉帆等(2005)的研究相似,可能是由于在線蟲侵染前期寄主防御系統開始起作用,血細胞開始大量分裂導致血淋巴總量急劇升高,之后隨著病原線蟲共生菌急劇增殖,紅棕象甲血細胞快速崩解致使后期血淋巴總量減低。

酯酶廣泛存在于昆蟲體內,起著生化調節、神經傳導及解毒代謝等作用(陳長琨,1993; 從斌等,1999)。肖猛(2000)和丁曉帆等(2005)采用EPNs接種家蠶BombyxmoriL.和大蠟螟Galleriamellonella(L.),均發現在供試時間內(0～24 h)血淋巴酯酶活性持續升高。本研究中紅棕象甲受EPNs侵染后,血淋巴酯酶活性呈現前期(0～36 h)升高后期(36～72 h)降低的趨勢。肖猛等(2000)認為,受線蟲侵染后酯酶活性升高是由于對酯類物質分解增多和分解性酶活性的增強;在本研究后期出現的酯酶活性逐漸降低情況,筆者認為可能是由于在線蟲侵染后期,隨著EPNs和共生細菌在紅棕象甲體內增殖,血淋巴內脂肪等物質被大量消耗,酯酶活性無法滿足免疫需求,導致酯酶活性逐漸降低。

昆蟲血淋巴蛋白與體內代謝、抗藥性及免疫調節等功能密切相關,血蜱雌蜱受嗜菌異小桿線蟲E67品系感染12 h后其血淋巴蛋白出現升高,在48 h后又出現顯著降低(高志華等,2006)。孫昊雨等(2014)研究表明,蠐螬感染嗜菌異小桿線蟲滄州品系后20 h內,血淋巴蛋白含量大幅度增加,隨后急劇降低,感染線蟲28 h后顯著低于同時間的對照(P<0.05)。本研究中,嗜菌異小桿線蟲H06品系侵染后,紅棕象甲血淋巴蛋白含量呈現持續降低的趨勢,雖在處理后60 h出現短暫的回升,但之后仍迅速降低。線蟲侵染紅棕象甲后,會大量消耗寄主體內的蛋白進行繁殖導致蛋白含量降低,但在60 h出現短暫回升的具體原因還有待進一步闡明。