黏質沙雷氏菌AHPC29對松樹萎蔫病的防治效果及其增菌條件

黃晨穎, 張艷芬, 吳守欣, 趙莉藺, 石 娟*

1北京林業大學,中法歐亞森林入侵生物聯合實驗室,北京 100083; 2中國科學院動物研究所,農業蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室,北京 100101; 3中國科學院大學,中國科學院生物互作卓越創新中心,北京 100049; 4河南省盧氏縣森林病蟲害防治檢疫站,河南 三門峽 472200

松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus(Steiner &Buhrer)是一種林業重大入侵生物,可引起被稱為松樹“癌癥”的松樹萎蔫病,造成重大的生態環境危害和經濟損失(趙添羽等,2022; Mamiya,1983)。自1982年入侵我國以來,松材線蟲在傳播媒介松墨天牛MonochamusalternatusHope的協助下,已擴散至19個省(區、市)、732個縣級行政區(國家林業和草原局2022年第6號公告),累計致死松樹超過6億株(寧靜等,2018; 張志國,2020)。目前,在對松樹萎蔫病的所有防治措施中,生物防治是對環境最友好的方法(李恩杰等,2019)。

黏質沙雷氏菌Serratiamarcescens廣泛分布于自然界,是水和土壤中的長居菌群。近年來研究發現,黏質沙雷氏菌在生防領域具有良好的應用潛力。傅仁杰等(2019)、Fuetal.(2021)從被感染的黑翅土白蟻Odontoternesformosanus(Shiraki)上篩選到的黏質沙雷氏菌SM1可以使健康的白蟻身體變紅死亡;涂爽等(2009)從中華蜜蜂ApisceranaFabricius腸道中分離到的黏質沙雷氏菌GEI通過產生的幾丁質酶能防治蜜蜂病害狄斯瓦螨VarroadestructorAnderson &Trueman;傅慧靜等(2020)研究發現,分離自松墨天牛腸道的黏質沙雷氏菌HX-3可通過產生木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶實現其對木質素的降解功能,從而降低蛀干害蟲的營養攝入。此外,還有不同黏質沙雷氏菌株防治亞洲柑橘木虱Diaphorinacitri( Kuwayama)若蟲(鄺凡,2019; Huetal.,2021)、黃脛小車蝗OedaleusinfernalisSaussure (馮書亮等,2002)、褐飛虱Nilaparvatalugens(Stal)、二化螟Chilosuppressalis(Walker)(王渭霞等,2014)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hubner)(楊建云等,2015; 趙曉峰,2017)等的報道。不同種類的黏質沙雷氏菌還對不同的植物病原細菌(Pressetal.,1997)、真菌(Purkayasthaetal.,2018; Wangetal.,2013)和病毒(Geetal.,2021)有抗菌活性。

本研究團隊從松墨天牛的蛹室及其氣管中篩選到一株黏質沙雷氏菌AHPC29,發現該菌對松材線蟲及其傳播媒介松墨天牛具有致死作用(Tianetal.,2022),但其對松樹萎蔫病的作用效果尚不清楚。為確定黏質沙雷氏菌AHPC29作為松樹萎蔫病生防菌劑的可行性,本研究測試了黏質沙雷氏菌AHPC29對人工感染松材線蟲松樹萎蔫病的防治效果,并研究了培養基組分和培養條件對其生長的影響,以期為該菌株作為生防菌劑進行生產應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

材料:菌株SerratiamarcescensAHPC29分離自安徽天牛蛹室(Tianetal.,2022)。松材線蟲蟲株從中國陜西省柞水縣發現的松材線蟲病枯死松樹中分離得到(Mengetal.,2020),在實驗室內用灰葡萄孢菌飼養。

試劑:LB培養基(酵母粉5 g·L-1、胰蛋白胨10 g·L-1、NaCl 10 g·L-1)、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉、乳糖、蛋白胨、尿素、谷氨酸、豆粉、復合氨基酸、KNO3、Ca(NO3)2、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4。

儀器:LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安)、YP5002電子天平(上海越平)、OptiMair超凈工作臺(新加坡ESCO)、HZQ-F100全溫振蕩培養箱(上海培英)、SpectraMaxi3酶標儀(美國Molecular Devices)。

1.2 方法

1.2.1 黏質沙雷氏菌AHPC29對松樹萎蔫病作用效果 選取生長狀態相近的2年生黑松PinusthunbergiiParlatore幼苗15株,以人工接皮法向每株黑松接種2000條線蟲,在28 ℃、180 r·min-1條件下在LB培養基上培養48 h后,將AHPC29原菌液根灌溉至5株接種過松材線蟲的黑松幼苗根部,每棵20 mL,無菌水處理的5株作為對照組,于溫室32 ℃繼續培養。每周根灌一次,45 d后,對照組黑松全部死亡,采集所有松樹樣品帶回實驗室,采用貝爾曼漏斗法對線蟲進行分離,使用倒置顯微鏡對線蟲進行計數,統計最終每株樹苗中的線蟲量。

1.2.2 培養基單組分篩選及其組合優化 以LB培養基為基礎,分別選用葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉、乳糖作為碳源,蛋白胨、尿素、谷氨酸、豆粉、復合氨基酸作為有機氮源,KNO3、Ca(NO3)2、NH4Cl作為無機氮源,K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4作為無機鹽,對培養基組分進行優化。碳源、氮源和無機鹽質量百分比濃度均參考LB培養基配方,分別為0.5%、1%和1%。進行各組分優化時,其余組分在28 ℃、180 r·min-1條件下在LB培養基上培養48 h,結束后用分光光度法測定光密度D600 nm,每處理3個重復。

基于培養基組分的單因素實驗結果篩選出的最優碳源、有機氮源、無機氮源和無機鹽組分,通過正交實驗確定各組分濃度,正交實驗方案采用L9(34)正交表。實驗條件為28 ℃、180 r·min-1,培養48 h后用分光光度法測定光密度D600 nm,每處理3個重復。

1.2.3 培養條件的影響 在以上已優化的培養基的基礎上,繼續設置單因素實驗對以下因素進行篩選:接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%)、裝液量(10%、20%、30%、40%、50%、60%)、搖床轉速(0、60、120、180、240 r·min-1)、培養溫度(25、28、30、35、37 ℃)、培養時長(12、24、36、48、60、72 h)。原始增菌的培養條件為接種量5%、裝液量30%、搖床轉速150 r·min-1、溫度28 ℃、時長24 h,以每一培養條件優化后的結果為基礎進行下一步培養條件的優化。

1.3 數據分析

統計分析使用IBM SPSS Statistics 21軟件,結果繪圖采用OriginPro 2017軟件。黏質沙雷氏菌AHPC29防治松材線蟲實驗結果統計分析采用獨立樣本T檢驗,培養基單組分篩選實驗結果和增菌條件優化實驗結果采用單因素方差分析。

2 結果和分析

2.1 黏質沙雷氏菌AHPC29對松材線蟲的作用效果

黏質沙雷氏菌AHPC29對感染松材線蟲松樹的作用效果如圖1所示。待對照組松樹全部死亡后,菌液處理組的松樹生長狀態依然良好,接種菌液組松樹的松材線蟲的數量與對照組相比降低88.5% (P=0.0016<0.01),說明黏質沙雷氏菌AHPC29對松樹萎蔫病的防治具有良好效果。

圖1 黏質沙雷氏菌AHPC29對松樹萎蔫病的作用效果

2.2 培養基組分對黏質沙雷氏菌AHPC29生長的影響

不同碳源條件下的黏質沙雷氏菌AHPC29的生長情況(圖2A)表明,黏質沙雷氏菌AHPC29在以乳糖為碳源時有最高D600 nm值,與以牛肉膏為碳源時的生長情況相近,且2種碳源條件下的生長效果均顯著優于其他碳源。以葡萄糖和蔗糖為碳源時,生長情況相對較差,說明黏質沙雷氏菌AHPC29對葡萄糖和蔗糖的利用率低于乳糖和牛肉膏。當以可溶性淀粉為碳源時,利用率最低。

圖2 不同培養基組分對黏質沙雷氏菌AHPC29生長的影響

不同有機氮源的測試分析結果表明,以復合氨基酸為有機氮源時,D600 nm值最高,且顯著高于以蛋白胨、尿素、豆粉和谷氨酸為氮源的生長情況(圖2B)。以谷氨酸為有機氮源時,D600值最低。蛋白胨、尿素、豆粉作為氮源時,生長情況之間無顯著差異。

不同無機氮源的測試分析結果(圖2C)表明,以硝酸鉀作為無機氮源時,黏質沙雷氏菌AHPC29有最高的D600 nm值,但是與以硝酸鈣作為無機氮源之間無顯著差異。以氯化銨為無機氮源時,生長狀況最差,其D600 nm值顯著低于以硝酸鉀、硝酸鈣為無機氮源的結果。

不同無機鹽的測試分析結果表明,以硫酸鎂作為無機鹽時,黏質沙雷氏菌AHPC29有最高D600 nm值,但是與以磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵作為無機鹽之間無顯著差異。以磷酸氫二鉀為無機鹽時,生長情況最差,其D600 nm值顯著低于以磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵和硫酸鎂作為無機鹽時的結果(圖2D)。

綜合以上結果,增菌培養基的碳源、有機氮源、無機氮源和無機鹽組分最佳選擇分別為乳糖、復合氨基酸、硝酸鉀和硫酸鎂。

2.3 培養基組合優化

根據上述篩選出的最佳碳源、有機氮源、無機氮源、無機鹽,進行四因素正交實驗,各因素均取3個水平,因素水平表見表1,正交實驗方案及結果分析見表2。極差值的大小可以表明該因素水平的改變對結果的影響大小,根據各因素下極差值的大小可以看出,各因素對黏質沙雷氏菌D600 nm值影響的主次順序為復合氨基酸>乳糖>MgSO4>KNO3。根據各因素下不同水平上實驗結果的平均值(k)可以看出,乳糖的最優水平為水平1代表的0.1%濃度,復合氨基酸的最優水平為水平1代表的0.5%濃度,KNO3的最優水平為水平1代表的0.5%濃度,MgSO4的最優水平為水平3代表的1.5%濃度,即培養基的最優組合為0.1%乳糖、0.5%復合氨基酸、0.5% KNO3、1.5% MgSO4。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗方案及結果分析

2.4 培養條件對黏質沙雷氏菌AHPC29生長的影響

在最優培養基的基礎上,分別測試增菌培養過程中接種量、裝液量、培養轉速、培養溫度對黏質沙雷氏菌AHPC29生長的影響,其結果如圖3所示。

圖3 不同培養條件對沙雷氏菌AHPC29生長的影響

按1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%的接種量分別接種后的增菌結果見圖3A。結果表明,接種量在1%～7%時,黏質沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值呈上升趨勢;接種量在7%～11%時,黏質沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值逐漸下降。盡管接種量為13%時D600 nm值有小范圍回升,依然低于接種量為7%時的D600 nm值。因此,選擇最佳接種量7%繼續進行裝液量、培養轉速、培養溫度和培養時間的優化。

裝液量10%、20%、30%、40%、50%、60%的實驗結果見圖3B。由圖可知,裝液量為40%時沙雷氏菌AHPC29的D600 nm值最高,且與其他裝液量的結果差異顯著,因此本實驗選用40%為最佳裝液量。

轉速為0、60、120、180、240 r·min-1的實驗結果如圖3C所示,其中轉速0 r·min-1下的增菌結果顯著低于其他轉速條件。盡管60 、120、180和240 r·min-1轉速之間的結果無顯著差異,但是轉速在0～180 r·min-1時,D600 nm值呈上升趨勢,轉速為180 r·min-1時,D600 nm值達到最高點,因此選擇180 r·min-1最為最佳轉速。

培養溫度是生長速率的關鍵影響因素之一,25、28、30、35、37 ℃條件下的增菌結果如圖3D所示。結果表明,35和37 ℃的高溫以及25 ℃條件均對黏質沙雷氏菌AHPC29的生長有顯著抑制作用。30 ℃的增菌結果顯著高于其他培養溫度,最有利于沙雷氏菌AHPC29生長。因此本研究選擇的最佳增菌溫度為30 ℃。

隨著培養時間的增長,黏質沙雷氏菌AHPC29的生長情況如圖3E所示。結果表明,12～24 h生長緩慢,屬于其生長調整期;在24～36 h內黏質沙雷氏菌AHPC29處于生長對數期;36～48 h時D600 nm值保持穩定,說明黏質沙雷氏菌AHPC29進入生長穩定期;培養60和72 h時,D600 nm值持續下降,說明黏質沙雷氏菌AHPC29進入衰亡期。

3 討論

本研究通過溫室實驗證實了黏質沙雷氏菌AHPC29對已感染松材線蟲的松樹具有良好的效果,表明其具有良好的松樹萎蔫病防治應用前景。

根據培養基各組分對黏質沙雷氏菌AHPC29生長影響的主次順序可以看出,有機氮源對黏質沙雷氏菌生長的影響最大,說明有機氮源是黏質沙雷氏菌AHPC29生長的關鍵組分。在微生物的培養過程中,無機氮源主要用于微生物的早期生長,有機氮源主要用于微生物中后期的生長和物質積累,因此一般將有機氮源和無機氮源混合使用(杜麗紅等,2019)。在測試的有機氮源中,復合氨基酸最有利于黏質沙雷氏菌AHPC29的生長,這應該與復合氨基酸直接含有的18種氨基酸成分可以直接用于微生物體內蛋白質合成以及脫氨轉氨作用相關(杜麗紅等,2019; 盧寅泉和劉照明,1995)。而谷氨酸作為有機氮源時的結果說明,僅有谷氨酸不能有效滿足黏質沙雷氏菌AHPC29生長對氮源的需求。豆粉、蛋白胨與尿素對黏質沙雷氏菌AHPC29的生長情況無顯著差異且均低于復合氨基酸,這與它們需要進一步水解或者分解之后才能利用的特點相一致。無機氮源的測試結果表明,黏質沙雷氏菌AHPC29對硝態氮的利用優于氨態氮。

對于黏質沙雷氏菌AHPC29,碳源是僅次于有機氮源的主要培養基組分。碳源是微生物生長的必需組分,為微生物提供細胞碳骨架以及生命活動所需的能量。在本研究中,作為雙糖的乳糖最有利于黏質沙雷氏菌AHPC29的生長,而淀粉作為多糖最難被利用,說明黏質沙雷氏菌AHPC29在碳源中偏好乳糖,對淀粉的利用能力較弱。牛肉膏中含有有機碳、氮、維生素以及無機鹽,盡管在大多數情況下它被作為氮源,但是本研究證實其可作為碳源顯著促進黏質沙雷氏菌AHPC29的生長,這與一些研究中的結果也相一致(陳雅麗,2014; 倪海軍,2016)。

在微生物的生長過程中,無機鹽主要作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑以及調節培養基的滲透壓、pH、氧化還原電位等。無機鹽的測試結果表明,黏質沙雷氏菌AHPC29在無機鹽KH2PO4、FeSO4、MgSO4之間的選擇無顯著偏好。K2HPO4和KH2PO4中的K+是磷酸丙酮酸轉磷酸酶等的輔因子,并且可以維持電位差和滲透壓,但兩者在pH值緩沖方面的作用不一樣,K2HPO4溶液為堿性,KH2PO4溶液為酸性。黏質沙雷氏菌AHPC29偏好使用KH2PO4,同時FeSO4、MgSO4也為酸性溶液,說明黏質沙雷氏菌AHPC29偏向利用酸性無機鹽。

根據培養條件的測試結果可以看出,裝液量、培養溫度和時長是關鍵的影響因素,其最佳裝液量為40%,最佳培養溫度30 ℃,最佳培養時長36 h。25、35和37 ℃溫度下的生長情況均顯著低于28和30 ℃的結果說明,低溫和高溫均不利于黏質沙雷氏菌AHPC29的生長,這與郝林華等(2006)的研究結果一致。接種量結果之間無顯著差異說明接種量對黏質沙雷氏菌AHPC29的生長影響不顯著。黏質沙雷氏菌為兼性厭氧菌(Smithetal.,2009),可在有氧或缺氧條件下生長,無轉速時的生長情況顯著低于有轉速的結果說明,有氧條件有利于黏質沙雷氏菌AHPC29的生長。