佛手瓜莖段組培快繁技術研究

王蘭蘭 李裕榮 陳之林 張朝君 杜致輝 文林宏

摘? ? 要：為建立佛手瓜完整的組培快繁體系，以佛手瓜莖段為外植體，探究外植體的最佳消毒條件；以篩選的MS為基本培養基，添加3%的蔗糖和0.7%的瓊脂，探究不同的激素配比對腋芽誘導、不定芽增殖和生根培養的影響。結果表明，佛手瓜莖段最佳消毒條件為75%酒精20 s + 0.1%氯化汞8 min；腋芽誘導適宜培養基為MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA和MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA，最佳增殖培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，平均增殖系數達4.01，最佳生根培養基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA，生根率為93.33%，最適的瓶外扦插生根條件為0.5 mg·L-1 NAA浸泡處理30 min。研究建立的佛手瓜組培快繁體系，為優質佛手瓜種質資源的保存提供了技術參考。

關鍵詞：佛手瓜；組織培養；瓶外生根

中圖分類號：S652.9 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2023）09-030-06

Study on tissue culture and rapid propagation via stem section of Schium edule

WANG Lanlan1， LI Yurong1， 2， CHEN Zhilin1， 2， ZHANG Chaojun1， 2， DU Zhihui1， 2， WEN Linhong1， 2

（1.Horticulture Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550025， Guizhou， China; 2. Guizhou Horticulture Engineering Technology Research Center， Guiyang 550025， Guizhou， China）

Abstract： In order to establish a complete tissue culture and rapid propagation system of stem section of Schium edule as explants， exploring the best disinfection condition， MS was used as the basic medium， 3% sucrose and 0.7% agar are added to explore the effect of different hormone ratios on axillary bud induction， adventitious bud proliferation and rooting culture. The results showed that the best disinfection conditions for stem segment of Schium edule was 75% alcohol for 20 s + 0.1% HgCl2 for 8 min， The suitable medium for axillary bud induction was MS+1.0 g·L -1AC+1.0 mg·L -1 6-BA+0.1 mg·L -1 NAA and MS+1.0 g·L -1AC+1.0 mg·L -1 6-BA+0.1 mg·L -1IAA， the best proliferation medium was MS+0.1 mg·L -1 NAA+1.0 mg·L -1 6-BA， and the average proliferation coefficient could reach 4.01， and the best medium for rooting was 1/2MS+0.2 mg·L -1 NAA， and the rooting rate was 93.33%， the optimum conditions of ex vitro cutting rooting was 0.5 mg·L -1 NAA soaking for 30 min. The tissue culture and rapid propagation system of Schium edule established in this study provides a technical reference for the preservation of succulent germplasm resources.

Key words： Schium edule; Tissue culture; Ex vitro rooting

佛手瓜（Schium edule）為葫蘆科佛手瓜屬多年生植物，是重要的瓜類蔬菜之一，原產于西印度群島、中美洲及墨西哥，在19世紀初傳入中國，全國大部分地區均有種植，以貴州、云南、福建、廣東等地種植最多[1-2]。佛手瓜的果實富含維生素、胡蘿卜素、碳水化合物、脂肪等物質成分，具有較高的營養價值[3-4]；此外，佛手瓜的提取物還有抗氧化、抗炎[5-7]、降血壓和調節血糖[8]等功效，具有較高的藥用價值。種植佛手瓜經濟效益顯著，助推多數地區農業的經濟發展，例如貴州省惠水、紫云等地[9]，因此受到廣大農戶和消費者喜愛。

佛手瓜常用扦插法和整瓜育苗法繁殖。扦插法繁育的佛手瓜苗長勢較弱，整瓜育苗也存在一定的缺陷，通常是將整個瓜埋入土中，爛瓜率高，且每個瓜只含有1粒種子，種子和果皮緊密貼合不易分離，種子離瓜后無法發芽，存在繁殖率低、成本高及生長過程中易受到病蟲害影響等問題，產業發展受到限制[10-11]。因此，加大對佛手瓜育苗相關技術的研究力度，特別是對種質資源的保存、新品種選育和種質創新意義重大，而以組織培養為基礎的現代生物技術在育苗方面具有巨大的優勢和潛力，可以在短時間內獲得大量優質的無病蟲害種苗。在瓜類蔬菜的相關研究過程中，建立高效的組織培養和再生體系是種質資源保存和新品種選育成功的關鍵性基礎。近年來，組織培養技術已經在瓜類蔬菜中得到廣泛應用，目前，多種瓜類蔬菜已經能夠通過器官發生途徑獲得再生植株，有的還建立了比較高效的再生體系[12]，但有關佛手瓜組織培養的研究報道較少，因此，筆者以佛手瓜帶腋芽莖段作為外植體，建立高效快速的快繁體系，為后續佛手瓜種質資源保存和新品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者以貴州省農業科學院園藝研究所蔬菜保育大棚種植的優良綠皮佛手瓜苗為試驗材料，選取帶腋芽的莖段作為外植體。該品種收集自貴州省黔南布依族苗族自治州惠水縣好花紅鎮。試驗于2021年11月至2022年7月在貴州省農業科學院園藝研究所園藝植物組織培養技術實驗室進行。

1.2 方法

試驗采用完全隨機區組設計。

1.2.1 佛手瓜外植體的選取和消毒 選取長勢良好的佛手瓜莖段作為外植體，剪成2 cm左右的1葉1節莖段，去除莖段葉片，加入洗潔精放置于流水下沖洗30～45 min，用軟毛刷刷掉表面殘留的灰塵，將沖洗后的莖段放入無菌超凈工作臺進行消毒處理，采用75%酒精（10、20、30 s）進行消毒，無菌水清洗3～5次，0.1%的氯化汞消毒（6、8、10 min），無菌水清洗5～6次，共計9個處理（表1），用無菌吸水紙吸掉莖段上多余的水分，接種至培養基中，放置于光照度2000 lx、溫度24 ℃、光照12 h條件下培養，每瓶接種3個帶腋芽莖段，每個處理接種20瓶，3次重復，15 d后統計外植體的污染率和存活率。污染率/%=（污染外植體數/總接種外植體數）×100，存活率/%=（存活的外植體數/總接種外植體數）×100。

1.2.2 佛手瓜腋芽萌發誘導 將消毒處理后的佛手瓜莖段接種于5種不同的培養基（表2）上培養，放置于光照度2000 lx、溫度24 ℃、光照12 h條件下培養，每個處理接種60個外植體，3次重復，15 d左右觀察腋芽萌發情況。腋芽出芽率/%=（萌發帶腋芽莖段數/總接種帶腋芽莖段數）×100。

1.2.3 佛手瓜繼代增殖培養基的篩選 將上一步誘導出的長到3～5 cm的腋芽無菌苗切成帶有1葉1節的莖段，接種到以MS為基礎培養基，分別添加不同激素質量濃度6-BA（0.5、1.0、2.0 mg·L-1）、NAA（0.01、0.1、0.2 mg·L-1）和IAA（0.01、0.1、0.2 mg·L-1）的培養基（表3）上進行增殖培養，每個處理接種30個外植體，3次重復，20 d后觀察并統計叢生芽增殖情況。叢生芽增殖系數=萌發的叢生芽數/接種總外植體株數。

1.2.4 佛手瓜生根誘導 待腋芽長到3～5 cm長時，在無菌條件下切下腋芽轉接到不同激素濃度IBA或NAA的1/2MS生根培養基中進行誘導，每個處理接種25個外植體，3次重復，15 d后觀察并統計植株生根情況（表4）。生根率/%=（生根組培苗數/接種組培苗數）×100；生根數=生根總條數/生根的外植體個數。

為建立佛手瓜瓶外生根繁育技術體系，采取另一種生根方法誘導生根。將3～5 cm長度的腋芽切下作為瓶外生根材料，研究NAA不同質量濃度（0.3、0.5、1.0 mg·L-1）和不同浸泡時間（30、60 min）對佛手瓜組培苗瓶外生根的影響情況（表5）。將腋芽切下浸泡處理后扦插到基質中進行生根誘導，每個處理接種50個外植體，3次重復，15 d后統計生長情況。扦插存活率/%=（扦插存活植株總數/總扦插植株數）×100。

1.2.5 佛手瓜煉苗和移栽 當佛手瓜植株生根或者根系發育基本穩定后，將培養瓶轉移至室外開蓋進行煉苗2～3 d，接著將植株根部的培養基洗凈，移栽到基質營養土中，進行常規水肥管理。同時將穩定后的佛手瓜瓶外生根扦插苗移栽至大棚中進行常規管理。

1.2.6 數據處理 使用Microsoft Excel 2010和SPSS 24進行數據統計處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對佛手瓜污染率和存活率的影響

在佛手瓜莖段的消毒處理中發現，選取佛手瓜莖段材料時，選擇莖粗較小且半木質化的材料較為合適，不同的消毒方式對莖段的污染率和存活率有一定影響（表1），莖段的污染率隨著0.1%氯化汞浸泡時間的延長逐漸下降，存活率呈先升高后降低的變化趨勢。其中利用75%酒精處理20 s、0.1%氯化汞處理8 min，存活率最高，達85.00%，污染率為10.56%。當0.1%氯化汞處理時間為10 min時，污染率降低，但對莖段產生的傷害較大，存活率降低，因此選擇75%酒精處理20 s、0.1%氯化汞處理8 min作為佛手瓜莖段的最佳消毒方式。

2.2 不同培養基對佛手瓜腋芽誘導的影響

將消毒好的佛手瓜莖段分別接種到不同的培養基中誘導（表2），發現帶腋芽的佛手瓜莖段在3個基礎培養基上都能夠進一步萌發和生長，在添加了6-BA結合NAA或IAA的培養基上，腋芽的萌發速度較快，出芽率相當，但是在基部易產生黃色松軟的愈傷組織且不能分化，影響腋芽的進一步生長，同時還發現與不添加活性炭（AC）的培養基相比，添加活性炭的培養基在佛手瓜基部產生的愈傷組織較少甚至不產生愈傷組織，葉色比較濃綠，莖稈粗壯、葉片大、節間短（圖1A～C），且MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA+1.0 g·L-1 AC和MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 g·L-1 AC出芽率高，分別為91.11%、91.67%，與其他處理呈顯著差異；MS出芽率最低，僅為82.78%。因此選擇MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA+1.0 g·L-1 AC和MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+1.0 g·L-1 AC作為佛手瓜腋芽誘導的基礎培養基。

2.3 不同激素處理對佛手瓜叢生芽增殖的影響

為了探究不同的激素處理對佛手瓜叢生芽增殖的影響，將誘導出的腋芽切下接種到不同激素處理的培養基中，合適的激素組合和濃度對芽的增殖培養有促進作用（表3）。隨著6-BA質量濃度從0.5 mg·L-1增加到2 mg·L-1，佛手瓜叢生芽增殖系數呈先升高后下降的趨勢，其中添加NAA的培養基叢生芽的增殖系數高于添加相同質量濃度IAA的培養基，因此選擇NAA作為佛手瓜叢生芽增殖的誘導激素。在MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA培養基中，佛手瓜叢生芽增殖系數達到4.01，植株長勢最好，葉片嫩綠，植株也較高，表現出良好的生長狀態（圖1-D）。隨著6-BA質量濃度增加到2.0 mg·L-1，植株基部出現大量愈傷組織，在培養過程中逐漸褐化，且抑制植株的生長和分化，增殖系數降低，因此選擇MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA作為佛手瓜叢生芽增殖培養的最佳培養基。

2.4 不同激素處理對佛手瓜生根的影響

為了探究不同的激素處理對佛手瓜生根的影響，將長到3～5 cm長的佛手瓜苗切下，轉入到不同激素處理的培養基中，發現10 d左右即可觀察到部分植株已經開始生根，15 d左右部分植株的根系長度可達3 cm，植株長勢較好。從表4可以看出，選擇NAA和IBA作為添加劑進行生根誘導，隨著濃度升高，生根率和生根條數都呈先升高后降低的變化趨勢，NAA與IBA相比，前者的生根率高于后者，因此NAA作為添加劑更適合佛手瓜的生根誘導，在NAA質量濃度為0.2 mg·L-1時生根率最高，達到93.33%，且生根條數也是最多的，平均生根數為6.67條，且在1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA條件下根粗而多、葉片大小中等、植株健壯、長勢較好（圖1 E～F），因此選擇該培養基作為佛手瓜生根誘導的最佳培養基。

2.5 不同激素處理對佛手瓜瓶外扦插生根的影響

為建立佛手瓜瓶外生根繁育技術體系，探究一種方便和節約時間的生根方式，待佛手瓜腋芽長到3～5 cm，直接將其剪下，采用激素浸泡處理后直接扦插。研究發現，NAA浸泡時間和濃度對佛手瓜扦插苗的存活率都有一定的影響，其中，浸泡60 min的存活率低于30 min（表5），在浸泡30 min條件下，存活率隨著NAA質量濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，在0.5 mg·L-1時存活率達到96.67%，與其他處理相比呈顯著差異，長勢較好，10 d左右可以有新根長出（圖1 G～H）。利用瓶外扦插有效避免了在瓶內生根后煉苗移栽對苗產生的損傷，因此選擇0.5 mg·L-1 NAA浸泡處理30 min作為最佳的佛手瓜瓶外扦插處理方式。

2.6 馴化移栽和管理

打開瓶蓋室溫煉苗2 d后，將佛手瓜幼苗取出，用自來水將根部的培養基洗凈，將多余水分晾干后移栽至基質中，進行常規的水肥管理（圖1-I），存活率在95%以上。同時將生根后的佛手瓜瓶外扦插苗移栽至大棚中，進行常規管理，長勢良好。

3 討論與結論

在植物組織培養過程中，外植體材料的消毒是否成功是建立無性系的第一步，消毒不徹底會導致外植體細菌和真菌的滋生，進而導致接種外植體死亡。佛手瓜莖段中空常常易殘留細菌，因此莖段的選取非常關鍵，經過多次試驗，發現選擇莖段較細且半木質化的外植體消毒后存活率更高。在對佛手瓜的消毒方面，前人的研究常采用次氯酸鈉和氯化汞[10，13-14]，但是都未進行系統的篩選，消毒效果未知。筆者的試驗采用75%酒精20 s結合0.1%氯化汞8 min的消毒效果較好，存活率在85.00%以上。

佛手瓜的組織培養過程中外植體的選擇也非常關鍵，前人的研究常用的外植體有幼葉、下胚軸及頂芽。趙建萍等[15]以佛手瓜幼葉為外植體誘導愈傷，但沒有進行愈傷分化成芽的研究，王小素[16]以佛手瓜下胚軸為外植體誘導愈傷分化成芽，但在后期的重復試驗中未能成功分化，可能是由環境或者品種不同引起的，后期會繼續探索。筆者的研究采用帶腋芽莖段作為外植體，取材較容易且能夠保持親本遺傳物質的穩定性，采用頂芽作為外植體時，消毒后褐化和死亡現象比較嚴重，這可能是因為頂芽部分材料較嫩，消毒時間不易把控。

在佛手瓜的組培快繁過程中，腋芽誘導分化和叢生芽的增殖需要細胞分裂素和生長素的共同作用，與6-BA、NAA和IAA的使用量密切相關。高濃度6-BA會使基部分化愈傷，但愈傷質量較差，一段時間后直接褐化，且還會抑制腋芽的誘導。在植物的初代培養中，加入適量的活性炭可防止褐變、促進新芽的形成和伸長[17]，筆者的研究表明，添加一定濃度的活性炭會有效抑制愈傷組織的分化，促進腋芽誘導，這與前人的研究結果相似[18]。在佛手瓜的增殖培養階段，添加1.0 mg·L-1 6-BA和0.1 mg·L-1 NAA都可以促進佛手瓜叢生芽的增殖，但2種激素的比例與前人的報道不一致[13，19]，可能與植物內源激素的含量有關。在生根階段，常選擇的激素有NAA、IBA和IAA等，其在瓶內或瓶外均有較好的生根誘導效果。瓶外生根有成本低、育苗周期短、簡單易行等特點，在獲得無菌苗較多的情況下此方法可作為生根誘導的首選[20-21]。筆者研究了不同的激素濃度和浸泡時間對佛手瓜瓶外生根的影響，結果表明，以0.5 mg·L-1 NAA浸泡30 min佛手瓜的存活率最高且長勢最好，利用此方法可節約成本和時間，縮短育苗周期，為佛手瓜的良種推廣提供參考。

筆者的研究結果表明，不同的消毒方式影響佛手瓜的污染率和存活率，佛手瓜莖段最佳消毒條件為75%酒精20 s + 0.1%氯化汞8 min；加入適量活性炭可有效抑制愈傷組織分化和促進芽的形成伸長，腋芽誘導適宜培養基為MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA和MS+1.0 g·L-1 AC+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA；NAA更適合佛手瓜的增殖培養，最佳增殖培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA，平均增殖系數可達4.01；最佳生根培養基為1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA，生根率為93.33%；最適的瓶外扦插生根條件為0.5 mg·L-1 NAA浸泡處理30 min。筆者建立的佛手瓜組培快繁體系為優質佛手瓜種質資源的保存提供了技術參考。

參考文獻

[1] 胡玉紅，王素梅，王肖鋒，等．無公害佛手瓜生產技術[J]．中國瓜菜，2006，19（1）：42-43．

[2] 朱瑛．佛手瓜采后生理及種子休眠特性研究[D]．陜西楊凌：西北農林科技大學，2007．

[3] CUI H N，ZHU Z C，LU Z K，et al．The complete chloroplast genome sequence of the Sechium edule （Jacq.） Swartz.（Cucurbitaceae）[J]．Mitochondrial DNA B Resour，2021，6（1）：97-98．

[4] 李玉．基于多變量分析的不同保鮮方法對采后佛手瓜品質變化的影響[D]．四川雅安：四川農業大學，2016．

[5] ROSADO-PéREZ J，AGUI?IGA I，SANTIAGO-OSORIO E，et al．Effect of Sechium edule var．nigrum spinosum （Chayote）on oxidative stress and Pro-inflammatory markers in older adults with metabolic syndrome：An exploratory study[J]．Antioxidants，2019，8（5）：146．

[6] KE J X，JIANG G Y，SHEN G H，et al．Optimization，characterization and rheological behavior study of pectin extracted from chayote（Sechium edule）using ultrasound assisted method[J]．International Journal Biological Macromolecules，2020，147：688-698．

[7] VIEIRA E F，PINHO O，FERREIRA I，et al．Chayote （Sechium edule）：A review of nutritional composition，bioactivities and potential applications[J]．Food Chemistry，2019，275：557-568．

[8] GAVIA-GARCíA G，ROSADO-PéREZ J，AGUI?IGA I，et al．Effect of Sechium edule var．nigrum spinosum （Chayote）on telomerase levels and antioxidant capacity in older adults with metabolic syndrome[J]．Antioxidants-Basel，2020，9（7）：634．

[9] 譚國飛，吳小玉，羅慶，等．瓜表皮有刺毛和無刺毛佛手瓜轉錄因子SeTTG1的分離及表達分析[J]．上海農業學報，2022，38（2）：10-16．

[10] 吳濤，朱玉靈，趙紅，等．佛手瓜組培快繁技術[J]．北方園藝，2000（4）：48．

[11] 雷軍．佛手瓜綠莖扦插快繁試驗研究[J]．農業科技與信息，2012（1）：26-27．

[12] 穆丁郁，張衛華．瓜類蔬菜組織培養研究綜述[J]．現代農業科技，2020（21）：81-84．

[13] 亓增軍．佛手瓜莖尖的快速繁殖技術[J]．山東農業大學學報，1999，30（4）：448-450．

[14] 林緯，黎起秦，盧繼英，等．佛手瓜離體繁殖的研究[J]．廣西農業科學，2002（6）：301-302．

[15] 趙建萍，徐麗麗．鹽分脅迫對佛手瓜愈傷組織誘導的影響[J]．煙臺師范學院學報（自然科學版），1994（1）：72-74．

[16] 王小素，李步勛，王廣東．佛手瓜下胚軸離體培養及再生植株[J]．西北農業大學學報，1997（1）：83-87．

[17] 王紅梅．活性炭在植物組織培養中的應用[J]．上海農業科技，2011（4）：19．

[18] 胡漪，王子怡，王依嘉，等．活性炭顆粒對黃芩組織培養快速繁殖的影響[J]．北京農學院學報，2022，37（3）：14-19．

[19] 柏新付，趙建萍，宋永軍．佛手瓜幼苗對鹽漬環境的反應[J]．煙臺師范學院學報（自然科學版），1995（1）：57-60．

[20] 徐航，趙英，韓曉燕，等．沙棘組培苗瓶外生根技術研究[J]．經濟林研究，2018，36（3）：182-186．

[21] 李黎，陳菲，曲彥婷．蔓越莓組培苗瓶外生根技術研究[J]．國土與自然資源研究，2016（5）：95-96．