基因組光學圖譜技術在產前診斷中的應用

許伊云，張沁欣，季修慶，周冉，羅春玉，王艷，孟露露，胡平，許爭峰（南京醫科大學附屬婦產醫院產前診斷中心，南京 210004）

基因組光學圖譜技術（optical genome mapping，OGM）被稱為新一代細胞遺傳學技術，是一種通過對超高分子量（ultra-high molecular weight，uHWM）DNA 進行熒光特異性標記以及線性化高分辨率成像，從而構建全基因組物理圖譜的新興技術。目前認為，OGM 以其大于230 kb 的長讀長，能夠在單次檢測中識別各種主要類型的結構變異（structural variation，SV），最高分辨率可達500 bp［1］，近年來已逐步被應用于生殖遺傳領域［2-3］。然而，OGM 在產前診斷中的相關研究較少，僅有少數學者對其在產前診斷中的應用進行了回顧性分析及評述，認為其在未累及著絲粒的染色體變異中的檢測效能與常規方法完全一致［4-5］。本研究以染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）聯合核型分析為對比，對OGM 在產前診斷中的可行性及有效性進行評估，以期進一步完善OGM 在產前診斷中的應用方案，深入剖析其在各類染色體變異中的檢測效能及優勢。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2022 年6 月至8 月于南京市婦幼保健院進行產前遺傳咨詢的病例60 例，年齡（29.3±4.1）歲，中位穿刺孕周23+3周（18～31+3周）。納入標準：（1）胎兒結構畸形；（2）超聲軟指標異常，包括頸項透明層（nuchal translucency，NT）增厚（≥3.0 mm）、鼻骨發育異常和輕度側腦室增寬（10～15 mm）［6］。排除標準：（1）多胎妊娠；（2）孤立性室間隔缺損、孤立性右位主動脈弓、孤立性永存左上腔靜脈、孤立性足內翻；（3）穿刺失敗、樣本量不足、培養或DNA 提取失敗等原因導致無法進行OGM、CMA 檢測。介入性產前診斷指征主要包括NT 增厚15 例，多發軟指標異常13 例，心血管畸形9 例，結構畸形合并軟指標異常7 例，其他超聲異常16 例。取得患者知情同意后獲取羊水樣本30 mL，由3 組實驗人員平行進行OGM、CMA 檢測及染色體核型分析，并對檢測結果進行盲法分析及致病性評估。本研究經南京市婦幼保健院醫學倫理委員會批準（批準文號：2021KY-118），患者及家屬知情同意。

1.2 主要儀器及試劑 羊水細胞培養基（德國Cytogen GmbH 公司），Quibit 雙鏈DNA 定量試劑盒、Quibit 熒光定量儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），超長片段DNA 抽提試劑盒、DLS DNA 標記試劑盒、Saphyr DNA 單分子成像平臺（美國Bionano Genomics 公司），DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN公司），基因芯片試劑盒及基因芯片平臺、雜交爐、洗滌工作站、掃描儀（美國Affymetrix 公司），FISH試劑盒（北京金菩嘉公司）。

1.3 OGM 檢測及分析取約5 mL 羊水接種于T25 培養瓶中，經培養及分瓶傳代至鋪滿2 個培養瓶后進行細胞凍存，其中約1／2 細胞用于uHMW DNA 提取，剩余細胞凍存備份。按照超長片段DNA 抽提試劑盒的標準化操作流程從＞50 萬的羊水細胞中提取uHMW DNA，并利用Quibit 雙鏈DNA 定量試劑盒、熒光定量儀以及脈沖場凝膠電泳完成基因組DNA 的定量及長度質控，要求大部分DNA 分子長度＞500 kb，濃度36～150 ng／μL。DLS技術（Direct Label and Stain）序列特異性標記使用DLS DNA 標記試劑盒完成，其主要流程包括基因組CTTAAG 6 個堿基序列標記，游離熒光基團的清除，均質化及DNA 骨架染色過夜，標記后產物定量。濃度4～12 ng／μL、標準差＜0.25 的樣本可直接上機。標記后的樣本置于4 ℃避光保存。標記后DNA 載入Saphyr 芯片，在Saphyr DNA 單分子成像平臺中實現線性化及成像。下機數據符合Bionano官方推薦的質控標準（https：／ ／bionanogenomics.com／wp-content／uploads／2018／04／30223-Saphyr-

Molecule-Quality-Report-Guidelines.pdf）：N50 讀長＞230 kb，比對率≥70%，每100 kb 14～17 個標記，有效數據深度＞80×，陽性標記偏差率3%～10%，陰性標記偏差率6%～15%。在芯片掃描完成后，利用Bionano Access 軟件（v1.7）進行基因組的從頭組裝，并通過與參考基因組（hg19）比對，實現各種類型SV 的檢出。數據分析前設置過濾條件如下：（1）CNV 算法：CNV 置信度＞95%，CNV 大小≥500 kb，關閉CNV masking 過濾器；（2）SV 算法：SV在對照人群中發生頻率≤1%，關閉SV masking 過濾器。過濾后檢索國際公認數據庫，包括ClinGen數據庫、OMIM 數據庫、Ensemble 數據庫、DECIPHER 數據庫、DGV 數據庫、PubMed 數據庫，對變異進行注釋及分析，并根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南［7］完成變異致病性的判讀。

1.4 CMA 檢測及分析 按照DNA 提取試劑盒說明書從10 mL 羊水中提取基因組DNA。根據Affymetrix 基因芯片平臺的標準操作流程進行酶切、接頭連接、PCR 擴增、磁珠純化、純化產物測定、DNA片段化、片段末端標記、雜交、洗滌染色、掃描。利用ChAS 軟件（v3.2）進行數據分析。檢索UCSC 基因瀏覽器、ClinGen 數據庫、DECIPHER 數據庫、gnomAD 數據庫、DGV 數據庫、PubMed 數據庫等國際公認數據庫，根據ACMG 指南［7-8］將拷貝數變異（copy number variation，CNV）分為致病、可能致病、臨床意義未明（variants of uncertain significance，VOUS），可能良性和良性，并主要報告＞100 kb 的致病、可能致病的CNV、VOUS 以及涉及明確印記基因致病的6、7、11、14、15、20 號染色體上＞10 Mb的純合區域。

1.5 染色體核型分析 取15 mL 羊水接種于2 個T25 培養瓶中雙線培養。按照G 顯帶染色體核型分析的常規流程［9］進行試驗，并參考國際細胞遺傳命名系統（International System for Human Cytogenetic Nomenclature，ISCN）2020 對染色體核型進行分析［10］。

1.6 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）將備份的羊水細胞培養至分裂中期，加入秋水仙素破壞紡錘體，再經低滲、預固定和固定后，根據OGM 提示的易位片段選擇商業化FISH探針與細胞雜交。選擇特異性熒光染料復染后進行觀察和分析。

1.7 統計學分析 統計學分析由SPSS 23.0 軟件完成。對病例的一般資料及OGM 檢測數據進行描述性統計分析。計量資料根據是否符合正態分布用或中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示；計數資料用頻數或率表示。采用卡方檢驗進行兩組間率的比較。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OGM 基因組組裝信息及變異檢出情況 60例樣本DNA 分子平均長度為（291.65±19.05）kb，平均DNA 分子N50 長度為（309.41±30.66）kb。經過濾后，單個樣本中CNVs 的中位檢出量為1（0～6）個，SVs 的平均檢出量為（76.9±11.0）個，累及基因的SVs 的平均檢出量為（39.2±6.4）個。

2.2 OGM 與CMA 聯合核型分析的檢測效能 60例病例中各類染色體變異的檢出情況見表1。OGM 和CMA 聯合核型分析的檢出率差異無統計學意義（P＞0.05）。以hg19 為參考基因組進行組裝，OGM 漏檢1 例15q11.2 區段約507 kb 的致病性微缺失，其在染色體非整倍體、CNV、三倍體檢測中的敏感性為93.8%，特異性為100.0%。將該漏檢病例的OGM 數據再次以hg38 為參考基因組進行組裝，該例CNV 能夠被OGM 檢出。

表1 OGM 與CMA 聯合核型分析在染色體非整倍體、拷貝數變異及三倍體中的檢出率比較［n（%）］

2.3 OGM 明確重復插入的位置及方向 在60 例病例中，共檢出6 例病例存在染色體微重復。OGM提示該6 例病例均為原位串聯重復。6 例病例的CMA、OGM 結果及OGM 提示的斷點區間見表2。以病例059 為代表病例，OGM 圖譜見圖1。

圖1 染色體微重復代表病例（病例059）的OGM 檢測結果

表2 染色體微重復病例CMA 及OGM 結果及斷點區間

2.4 OGM 額外檢出隱匿性易位 在60 例病例中，OGM 較CMA 聯合核型分析額外檢出了2 例（3.3%）隱匿性易位，包括1 例隱匿性非平衡易位和1 例隱匿性平衡易位（表3），且均經FISH 驗證證實。其中病例039 孕婦既往曾有2 次稽留流產史。經親代溯源，該平衡易位被證實為父源遺傳。病例039 的OGM 及FISH 驗證結果見圖2。

圖2 隱匿性平衡易位病例（病例039）OGM 及FISH 驗證結果

表3 OGM 額外檢出隱匿性易位的斷點信息

2.5 OGM 檢測周期及檢測成功率 用于OGM 檢測的中位初始羊水投入量為5.5（4～8.5）mL，羊水細胞培養的中位天數為12（11～19）d。OGM 檢測及分析周期約為5 d。OGM 檢測成功率為100%。

3 討論

OGM 是一種能夠一站式識別各種主要類別SVs 的綜合性檢測技術。根據本研究數據，以hg19為參考基因組，OGM 漏檢1 例15q11.2 區段的復發性CNV，該CNV 兩側斷點位于片段重復區。DNA分子在該區段組裝困難，無法生成跨越兩側斷點的OGM 圖譜，因此導致假陰性結果的出現。但總體而言，本研究中OGM 與CMA 聯合核型分析的檢出率差異無統計學意義。尤其在以hg38 為參考基因組組裝后，OGM 的敏感性和特異性均達到100%。本研究再次證實了OGM 在產前診斷中的有效性及可靠性。

OGM 能夠明確重復插入的位置及方向。染色體微重復的致病性可能與三倍劑量敏感、基因內復制導致閱讀框破壞、基因間復制斷裂點破壞基因或導致基因融合相關。研究發現，83%的重復為原位串聯重復，另有17%為易位插入、復雜結構重排等其他類型的重復，提示了在對染色體微重復的致病性評估中結合斷點分析的重要性［10］。相較于CMA，OGM 的一大突出優勢為SV 算法的直觀性，其能夠可視化描繪重排模式。本研究中，OGM 提示6 例染色體微重復均為原位串聯重復。盡管本研究未發現重復導致基因破壞或基因融合的病例，但已有相關研究報道提示了OGM 在全面評估重復插入片段致病性中的優勢所在［11］。

OGM 能夠檢測核型分析無法識別的隱匿性染色體重排。平衡性結構重排能夠通過破壞基因或影響遠程調控相互作用而導致表型。近年來，已有多篇研究［2-3］將OGM 用于不明原因多次不良孕產史以及不孕不育患者的診斷，揭示了OGM 在精細化斷裂點區間的優勢所在，認為其可作為臨床檢測隱匿性平衡性染色體重排的一線方法。本研究通過OGM 診斷了1 例隱匿性平衡易位，并描繪了斷裂點區間，提示5 號染色體斷點位于WWC1基因內，但該基因與胎兒異常表型無關。此外，經過溯源，發現該平衡易位為父源遺傳，從而為該孕婦兩次稽留流產找到了原因。此對夫妻再生育可考慮植入前遺傳學檢測，從而避免不良妊娠結局的發生。由此可見，OGM 在SV 檢測中的另一大優勢為高分辨率檢測隱匿性染色體重排、精細化斷裂點區間協助SV 致病性判讀。

目前OGM 對產前樣本的要求仍然較高，無法使用未經培養的羊水樣本直接提取DNA。本研究中羊水細胞中位培養天數為12 d，檢測成功率為100%，提示了OGM 應用于產前診斷的可行性。目前OGM 檢測的限速步驟主要在于羊水細胞培養以及上機后數據產出及分析過程。本研究中初始羊水投入量較少，臨床應用時可通過增加初始羊水投入量以及羊水細胞接種面積縮短細胞培養時間。此外，Saphyr 系統若能實現通量的提升，則可進一步縮短診斷周期，以利于OGM 的產前應用。

目前OGM 產前應用限制主要在于以下幾個方面。首先，羊水細胞培養存在失敗風險，診斷周期有待進一步縮短；其次，對于檢出的部分SV 無法直接進行致病性評估，需結合測序數據進行深入分析；再者，其檢測效能，尤其是對于斷點位于片段重復區的SV 檢測的準確性仍需更多前瞻性數據積累及評估。然而，隨著技術的完善、算法的優化以及Saphyr 系統的進一步升級，OGM 有望成為產前SV檢測的一線方案。