時間與功率對BL21大腸桿菌超聲破碎效果的影響

鄢樹楓,王鈺坪,吳珊濤,王曉媛,戴心如

(三明學院 資源與化工學院,福建 三明365004)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種原核生物,革蘭氏染色反應呈紅色,在自然界中分布廣泛,主要寄居在人和動物的腸道等部位[1-2]。大腸桿菌由于其結構簡單、遺傳背景清楚、表達效率高、易培養、分子操作簡單和副產物表達量少等特性,常作為科研生產中原核表達宿主菌,廣泛應用于生物學研究中,因而受到眾多研究者的親睞[3-5]。

胞內蛋白質提取純化首先要對大腸桿菌進行高效破碎。大腸桿菌的破碎方法主要可分為機械法和非機械法,常見的機械法主要包括勻漿法、研磨法和超聲波破碎法等,非機械法主要有滲透法、酶溶法和凍溶法等,各種破碎方法均有其最佳適用范圍及其優缺點[6]。超聲破碎法破碎細胞具有速度快、操作方法簡單等優點,更適合于實驗室使用,短時間即可完成一個樣品處理,成本低廉[7]。超聲波在液體中的空化效應會形成空化泡,空化泡不斷擴大或突然崩解,使細胞壁裂開或破碎,以達到破碎細胞的目的。梁蕊芳[8]等通過研究不同菌種濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌在不同超聲功率、超聲時間下的細胞破碎效果,證明超聲破碎對幾種常見菌體均有良好的破碎效果。值得注意的是,使用超聲破碎細胞的影響因素較多,尤其是超聲破碎可能會對可溶性蛋白和包涵體的得率造成影響,這是由于在超聲破碎過程中超聲波的作用較為劇烈,可能會對蛋白質的結構和活性等方面造成影響[9]。趙燁清等[10]在研究中發現,超聲破碎法可能使可溶性蛋白質發生變性沉淀,這使得后續的蛋白質分離純化更加復雜,需要額外的復性環節。余雁等[11]研究了超聲波破碎方法中各種物理參數及其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌破碎的影響,證明超聲破碎的系列參數對破碎效果具有顯著的影響作用。彭贊國等[12]以超聲、高壓勻漿和化學滲透法破碎重組大腸桿菌,研究了超聲功率、菌體體積、菌體濃度對超聲破碎的影響,證明超聲破碎受到多種因素的調控,這些因素對超聲破碎的效果具有直接的調控作用。菌體破碎是目標蛋白分離純化的首要步驟,超聲破碎產生的局部高溫可能使破碎后釋放的蛋白質變性,對后續的蛋白質提取和純化環節有顯著影響[13]。

BL21(DE3)是大腸桿菌表達菌株,以T7 RNA 聚合酶為表達系統的高效外源基因的蛋白表達宿主,已廣泛應用于各類蛋白表達,其破碎效果的優劣能夠顯著影響后續蛋白質的表達純化效果[14]。然而,當前BL21大腸桿菌的超聲破碎影響因素研究不足,尤其是BL21大腸桿菌的超聲破碎效果與功率的相關性研究有待深入。因此,研究不同功率對BL21大腸桿菌超聲破碎的效果,探究其最佳的破碎功率和時間,對于蛋白質的表達純化具有重要意義。本研究以BL21大腸桿菌為實驗宿主菌,研究不同功率對其超聲破碎的效果,設置不同時間和功率梯度對大腸桿菌BL21進行超聲破碎,并獲取其胞內蛋白質,通過蛋白質濃度檢測及考馬斯亮藍(Bradford法)測定蛋白質含量,進而評價大腸桿菌BL21的超聲破碎效果,以期為大腸桿菌超聲破碎的研究和應用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗相關化學試劑胰蛋白胨、氯化鈉、酵母提取物、Tris-HCl、甘油、考馬斯亮藍G-250、乙醇等主要購買于阿爾法化工有限公司、西格瑪奧德里公司和上海碧云天生物科技有限公司。大腸桿菌BL21(DE3)菌種由中國科學院福建物質結構研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化、復蘇及其生長曲線測定

將從- 80℃冰箱中取出的菌種轉移進超凈工作臺中,將其在含有3 mL液體培養基的試管中進行接種,采用封口膜封口,放置于恒溫搖床震蕩培養,同時試管要保持傾斜,溫度為37℃,轉速為220 rpm,過夜培養16～18 h。隔天對菌種進行分裝凍存,并取適量菌用于生長曲線的測定。

取2.5 mL已復蘇菌液,將其在含有100 mL LB(Luria-Bertani)液體培養基的錐形瓶中進行接種,混合均勻后,放置于恒溫搖床振蕩培養,溫度為37℃,轉速為220 r/min。取一空白的培養基3 mL置于比色皿中,作為分光光度計空白對照。設定合理間隔時間,分別取2 mL菌液測600 nm處的吸光度值(OD600nm),記錄數據,測滿24 h。根據所得數據,繪制BL21菌株生長曲線。

1.2.2 菌體收集

如上述方法接種適量菌液(100 mL),于OD600nm達到0.6時,加入0.1 mmol/L誘導劑異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導胞內蛋白質表達,于搖床中持續培養18 h。將完成過夜培養的菌種倒入離心管中進行收菌,于離心機中以5 000 r/min轉速離心5 min,使菌體和培養液分離。離心完成后用移液槍吸棄上清液,保留沉淀,將沉淀置于冰上保存,維持胞內蛋白質穩定性。

1.2.3 超聲破碎

將上述獲得的菌體沉淀用30 mL預冷的裂解緩沖液重懸,得到的菌液濃度經計算為3.772×109cfu/mL(OD600nm=1.886)。重懸時注意要充分將菌體重懸,避免因菌塊存在導致后續破碎效果下降。重懸后將溶液轉移至50 mL離心管中,置于超聲破碎儀中進行破碎。為避免在超聲破碎過程中蛋白質因局部高溫變性,將待破碎的菌液管放置于裝有冰塊的燒杯中。設置破碎模式為破碎1 s,間隔1 s。每次破碎后的菌液均取1 mL裝入EP(eppendorf)管中待測。設計實驗組,分別以破碎時間和破碎功率為變量研究大腸桿菌BL21的超聲破碎效果,實驗組如表1。

表1 BL21超聲破碎實驗組

1.2.4 蛋白質濃度檢測(蛋白質濃度儀檢測法與考馬斯亮藍染色法)

將超聲破碎完成后得到的各實驗組EP管菌液放置于高速離心機中,以12 000 r/min轉速離心10 min,使蛋白上清液與細胞碎片分離。離心后,將上清液轉移至另一新EP管中保留,棄去沉淀。

蛋白質濃度儀檢測法。使用核酸蛋白檢測儀對各組上清液樣品進行蛋白質濃度檢測,測試三次計算平均值,記錄數據。

考馬斯亮藍染色法。從前述獲得的蛋白質上清液中取15 μL加入至準備好的500 μL考馬斯亮藍G-250工作液,混勻,觀察顏色及其與對照管的區別。分別從各組染色混合液取1 mL,加入2 mL蒸餾水稀釋,充分混合,并測量其于595 nm處的吸光度值(考馬斯亮藍染色后的特征吸收峰,OD595nm),測試3次,計算平均值,記錄數據。對照組以515 μL考馬斯亮藍G-250工作液和2 mL蒸餾水混合,作為分光光度計的參比溶液。

2 實驗結果與分析

2.1 大腸桿菌生長曲線

取適量大腸桿菌BL21進行生長曲線測定,不同時間點測量菌液的OD600nm值,記錄數據,繪制BL21菌株的生長曲線。由圖1可知,接種后,0～2 h是大腸桿菌BL21的生長延滯期(復蘇期),該階段菌體增殖分裂較為緩慢,正在適應新環境并復蘇其狀態;3～10 h是大腸桿菌BL21的對數生長期,該階段菌體增長迅速,呈“對數”型增長,此時菌體在快速增殖分裂,菌活力也在快速提高;11 h左右后,菌數量與菌活力接近達到最大值;繼續培養后,受限于培養基消耗、菌瓶容量等生長環境因素,其生長進入平穩期,逐步減慢增殖分裂速度。以上實驗符合標準化大腸桿菌的生長曲線,證明實驗所用大腸桿菌BL21能夠維持較好的生長態勢,滿足后續蛋白質表達及實驗要求。

圖1 大腸桿菌BL21的生長曲線

2.2 BL21超聲破碎實驗組1的結果

根據實驗組1設定,探究大腸桿菌BL21在破碎功率5%、遞增時間為1 min時的破碎效果。由圖2可知,上清液蛋白質濃度和大腸桿菌BL21的破碎時間呈近似線性關系(正相關)。上清液蛋白質濃度隨破碎時間增加而增加。圖3的實驗組1破碎上清液的蛋白質的考馬斯亮藍染色結果與蛋白質濃度的測定結果相吻合,其藍色程度隨破碎時間增加而逐漸加深,證明上清液中蛋白質含量亦逐漸提高。

圖2 實驗組1中破碎上清液的蛋白質濃度

圖3 實驗組1中破碎上清液的蛋白質的 考馬斯亮藍染色

2.3 BL21超聲破碎實驗組2的結果

根據實驗組2的設定,探究大腸桿菌BL21在破碎功率5%、遞增時間為3 min時的破碎效果。由圖4可知,上清液蛋白質濃度和大腸桿菌BL21的破碎時間呈近似線性關系(正相關),上清液中蛋白質濃度隨破碎時間增加而逐步遞增。由圖5可知,實驗組2破碎上清液的蛋白質經考馬斯亮藍染色后在595 nm處的吸光度值(OD595nm)隨破碎時間而增加。這個結果表明,隨破碎時間增加,上清液中考馬斯亮藍染色程度更深,上清液中蛋白質含量亦逐漸提高。

圖4 實驗組2中破碎上清液的蛋白質濃度

圖5 實驗組2中破碎上清液經考馬斯亮藍染色后在595nm處的吸光度值(OD595nm)

2.4 BL21超聲破碎實驗組3的結果

根據實驗組3的設定,探究大腸桿菌BL21在破碎功率5%、遞增時間為5 min時的破碎效果。由表2可知,破碎功率為5%時,隨破碎時間增加,上清液蛋白質濃度也增加,蛋白質濃度和破碎時間呈正相關。并且在前20 min破碎時蛋白質濃度上升趨勢較大。20 min后蛋白質濃度的上升趨勢減緩,可能原因為此時菌體已大部分破碎完成,待破碎的菌量較少。經考馬斯亮藍染色后在595 nm處的吸光度值(OD595nm)的變化趨勢與蛋白質濃度結果相一致,在5～15 min階段上升明顯,15～30 min出現波動。該結果與前述的實驗組1和實驗組2的結果相吻合,進一步證明大腸桿菌BL21的破碎效果即上清液蛋白質濃度與破碎時間呈正相關。

表2 實驗組3中破碎上清液的蛋白質濃度及OD595nm

2.5 BL21超聲破碎實驗組4的結果

根據實驗組4的設定,探究大腸桿菌BL21分別在破碎功率1%、3%和9%時的破碎效果(固定1 min破碎時間),結果如表2,圖4所示。

結合表3、圖6～7可知,固定1 min破碎時間時,大腸桿菌BL21的破碎效果與破碎功率呈正相關關系,功率為1%時,蛋白質濃度為509.4 μg/mL;功率為3%時,蛋白質濃度為576.8 μg/mL;功率為9%時,蛋白質濃度為641.8 ug/ml,呈現逐步上升趨勢。各組別經考馬斯亮藍染色后在595nm處的吸光度值(OD595nm)的變化趨勢與蛋白質濃度的結果相一致,隨破碎功率的遞增(1%,3%,9%),考馬斯亮藍染色后的OD595 nm值亦逐步遞增,表明破碎功率的提升有助于獲得更多的上清液蛋白,該結果與前述的實驗組1、2和3的結果相吻合,證明大腸桿菌BL21的破碎效果與破碎時間、破碎功率呈正相關。

圖6 實驗組4中破碎上清液的蛋白質濃度

圖7 實驗組4中破碎上清液經考馬斯亮藍染色后在595nm處的吸光度值(OD595nm)

表3 實驗組4中破碎上清液的蛋白質濃度及OD595nm

3 結論

本文以BL21大腸桿菌為實驗宿主菌,研究不同時間和功率梯度對其超聲破碎效果的影響。研究結果表明,超聲功率對大腸桿菌BL21破碎效果有明顯影響,破碎功率固定為5%時,破碎效果與破碎時間呈正比,菌充足的情況下,破碎時間越長其破碎效果越好;當破碎時間固定為1 min時,破碎功率從1%、3%和9%逐級遞增時,其超聲破碎效果亦逐漸提升,證明破碎效果與破碎功率呈線性關系。