廣西壯族人群ADIPOQ 基因rs2241766T／G 多態性與T2DM 易感性的相關性分析*

劉義，黃麗紅，李想，王鳳，王禹，喬永超（桂林醫學院附屬醫院.檢驗科，.老年病科，廣西桂林 541004）

2 型糖尿?。═2DM）是一種多基因遺傳的進行性代謝疾病，其發生及演變與環境和遺傳因素密切相關［1］。目前，臨床上已對T2DM 的遺傳易感性進行了大量研究，其中，脂聯素基因（ADIPOQ）不同位點單核苷酸多態性（SNP）與T2DM 及其代謝參數間的關系在不同人群中被廣泛報道［2-4］，然而，上述文獻結果存在明顯的不一致性。

一項薈萃分析結果表明，ADIPOQ基因rs2241766 SNP 與歐洲和東亞人群T2DM 不相關，并且對南亞和西亞人群的T2DM 影響結果呈現相反性［5］，其TG、TT 和TT+TG 基因型增加了西亞人群的T2DM 風險（P分別為0.02，0.01，0.01；OR分別為2.22，2.29，2.28；95%CI：1.14～1.32，1.21～4.34，1.21～4.28），但卻降低了南亞人群的T2DM 風險（P分別為0.009，0.005，0.004；OR分別為0.54，0.53，0.53；95%CI：0.34～0.86，0.34～0.83，0.34～0.82）。這使得rs2241766 SNP 對T2DM 易感性的影響存在爭議，上述SNP 的分布差異可能與人群、種族和地區相關，分布不同對T2DM 易感性的影響也不同。本研究旨在探討廣西壯族人群rs2241766 SNP 與T2DM 易感性及其多種代謝指標之間的潛在相關性，以期為T2DM 的早期預防、診斷、治療及群體遺傳學研究等提供實驗依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 招募2021 年9 月至2022 年1 月于桂林醫學院附屬醫院內分泌科就診的212 例T2DM 患者作為T2DM 組，其中男117 例，女95 例，年齡39.0～56.8 歲，中位年齡49.0 歲。納入標準：T2DM 患者均遵循2020 年美國糖尿病協會的診斷標準［6］；均無相關藥物治療史（如二甲雙胍、磺酰脲類、吡格列酮及胰島素等用藥）；均未合并重大并發癥（如腎病、腦卒中、視網膜病變等）；均無糖尿病家族史。排除標準：排除T2DM 外的其他類型糖尿?。ㄈ? 型糖尿病和妊娠性糖尿病等）；均排除肝、腎、肺、心腦血管、自身免疫、重度感染、惡性腫瘤等重大疾??；排除具有重大外傷及近期手術史的患者。納入同期在桂林醫學院附屬醫院體檢中心體檢的289 例健康志愿者作為健康人對照組，其中男116例，女173 例，年齡35.0～48.0 歲，中位年齡42.0歲。各研究對象均屬于獨立的廣西壯族個體，個體間均無親緣關系。本研究方案獲得桂林醫學院附屬醫院醫學倫理委員會審核批準（批準文號：QTLL202123），各研究對象均知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 QT-1 漩渦混合器（上海琪特分析儀器公司），TD5A-WS 臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器公司），DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備公司），FR-110 紫外分析裝置、FR-250 電泳儀（上海復日科技公司），多用途水平電泳槽（北京百晶生物科技公司），2720 Thermal Cycler 擴增儀、3130xl genetic analyze 分析儀（美國ABI 公司），Cabas8000 全自動生化免疫分析儀（上海羅氏診斷產品公司），Autolumo A2000 Plus 全自動化學發光測定儀（鄭州安圖實驗儀器公司）。DNA 全血提取試劑盒（北京天根生化科技公司），SNPscanTM分型試劑盒、Tag DNA 連接酶（50 U／μL）、Tag DNA 連接緩沖液購自上海天昊生物科技公司，10×PCR 緩沖液、dNTP mix（2.5 mmol／L）、TaKaRa HotStart Taq DNA 耐熱聚合酶（5 U／μL）購自日本TaKaRa 公司，Hi-Di 甲酰胺、GeneScanTM-600 染料購自美國ABI 公司，MgCl2（25 mmol／L）購自上海生工公司，葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶法）、尿素／尿素氮檢測試劑盒（比色法）、肌酐檢測試劑盒（苦味酸法）、三酰甘油檢測試劑盒（比色法）、膽固醇檢測試劑盒（酶比色法）、高密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒（酶比色法）、低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒（直接法）及C 反應蛋白檢測試劑盒（免疫比濁法）均購自上海羅氏診斷產品公司，促腎上腺皮質激素檢測試劑盒、血管緊張素2 檢測試劑盒、醛固酮檢測試劑盒、腎素檢測試劑盒、人生長激素檢測試劑盒、胰島素樣生長因子1 檢測試劑盒、人皮質醇檢測試劑盒（均為磁微?；瘜W發光法）購自鄭州安圖生物工程公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及臨床生化指標測定 采集各研究對象體檢或就診時的空腹靜脈血3～5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，3 000 r／min 離心5 min，分離血漿和白膜層血液，置于2.5 mL EP 管中。嚴格按照試劑盒及儀器說明書操作檢測血漿標本的各項臨床生化指標，包括：空腹血糖（FPG）、尿素（Urea）、肌酐（Cr）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、C 反應蛋白（CRP）、促腎上腺皮質激素（ACTH）、血管緊張素2（AⅡ）、醛固酮（ALD）、腎素（REN）、生長激素（GH）、胰島素樣生長因子1（IGF-1）及皮質醇（Cor）。各指標的參考區間：FPG：3.9～6.1 mmol／L；Urea：2.14～7.14 mmol／L；Cr：男性62～106 μmol／L，女 性44～80 μmol／L；TG：＜2.26 mmol／L；TC：＜5.2 mmol／L；HDL-C：1.16～1.55 mmol／L；LDL-C：＜3.37 mmol／L；CRP：＜5 mg／L；ACTH：7.2～63.4 pg／mL；A Ⅱ：25～129 pg／mL（臥位）；ALD：40～310 pg／mL（站位）；REN：4～38 pg／mL（站位）；GH：男性＜0.02 ng／mL，女性0.024～5.419 ng／mL；Cor：4.26～24.85 pg／dL。

1.3.2 DNA 樣本制備及濃度、純度鑒定 取200 μL白膜層血液樣本，按照人類基因組DNA 全血提取試劑盒說明書進行基因組DNA 提取。取1 μL DNA 樣本通過紫外分光光度儀檢測其吸光度（A260nm／A280nm）值，選取比值為1.7～2.0，濃度30～50 ng／μL，總量大于600 ng 的DNA 樣本置于-80 ℃儲存。

1.3.3 引物設計與合成 利用NCBI 在線數據庫查詢ADIPOQ基因rs2241766 位點的堿基序列，引物片段大小305 bp。采用Primer Premier 3.0 軟件設計引物，并委托上海天昊生物科技公司進行引物合成。上游引物序列：5＇-TGAGTCGTGGTTTCCTGG TCAGGA-3＇，長度24 bp；下游引物序列：5＇-TTTGA GTCGTGGTTTCCTGGTCAGGC-3＇，長度26 bp。退火溫度58～62 ℃，產物片段大小80～150 bp。

1.3.4 PCR 擴增及分型檢測 樣本裂解總體積為10 μL，包括：30～50 ng／μL DNA 樣本4 μL，2.5 μL 4×DNA 連接緩沖液，3.5 μL ddH2O。樣本裂解參數：98 ℃裂解5 min 后立即冰置。連接反應總體積為20 μL，包括：10 μL 裂解DNA 樣本，2 μL 10×DNA 連接緩沖液，50 U／μL DNA 連接酶0.5 μL，1 μL連接探針混合物，6.5 μL ddH2O。連接反應參數：94 ℃1 min，58 ℃4 h，循環4 次；94 ℃2 min，72 ℃保存連接產物。多重熒光PCR 反應總體積為20 μL，包括：10 μL 2×PCR 混合物，1 μL 多重引物混合物Ⅰ／Ⅱ，1 μL 連接產物，8 μL ddH2O。多重熒光PCR 反應參數：95 ℃2 min；94 ℃20 s，62 ℃40 s（每個循環-0.5 ℃），72 ℃1.5 min，循環9 次；94 ℃20 s，57 ℃40 s，72 ℃1.5 min，循環25 次；68 ℃1 h，4 ℃保存產物。取1 μL 稀釋10 倍的PCR 產物、0.5 μL Liz600 分子量內標與8.5 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性5 min 后用ABI 3730XL 測序儀進行熒光毛細管電泳分離，最終通過Gene-Mapper 4.1軟件根據產物應有的位置是否出現檢測峰判斷是否有對應的等位基因，從而確定分型結果，各基因型包括：GG（單峰）、TG（雙峰）和TT（單峰）。

1.4 統計學分析 采用SPSS 27.0 軟件進行統計學分析。統計數據均以樣本量100 為界限進行Kolmogorov-Smirnov 或Shapiro-Wilk 正態性檢驗，符合正態分布的計量資料均以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，兩組以上比較采用One way ANOVA 檢驗；非正態分布的計量資料均以中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，兩組以上比較采用Kruskal-WallisH檢驗。組間計數資料比較及Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律采用χ2檢驗；采用二元Logistic回歸進行基因多態性遺傳風險分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 廣西壯族T2DM 患者與健康人群rs2241766T／G 多態性的比較ADIPOQ基因rs2241766T／G 位點的基因型和等位基因頻率分布如下：T2DM 患者：GG（5.7%）、TG（44.3%）、TT（50.0%），G（27.8%）和 T（72.2%）；健康對照人群：GG（11.8%）、TG（37.7%）、TT（50.5%），G（30.6%）和T（69.4%）?；蛐皖l率符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（T2DM 組：χ2＝2.57，P＝0.28；健康人對照組：χ2＝4.62，P＝0.1），表明所選研究對象的ADIPOQrs2241766T／G 基因型分布具有良好的群體代表性。T2DM 組與健康人對照組間基因型頻率差異具有統計學意義（χ2＝6.294，P＝0.043）；兩組間等位基因頻率相近，差異無統計學意義（χ2＝0.918，P＝0.338）。見表1。

表1 廣西壯族T2DM 患者及健康人群ADIPOQ 基因rs2241766 SNP 的頻率分布及風險評估

2.2 廣西壯族 T2DM 患者ADIPOQ基因rs2241766T／G 多態性的風險評估 Logistic 回歸結果顯示，相比于GG 基因型，TG（OR＝2.443，95%CI：1.197～4.988，P＝0.014）、TT（OR＝2.057，95%CI：1.017～4.159，P＝0.045）及TG+TT（OR＝2.222，95%CI：1.122～4.402，P＝0.022）基因型與T2DM 風險增加顯著相關。在調整性別和年齡共同混雜因素后，此相關性仍持續存在，rs2241766T／G 的TG、TT 及TG+TT 基因型患T2DM 風險分別是GG 基因型的2.863 倍（OR＝2.863，95%CI：1.352～6.060，P＝0.006）、2.291 倍（OR＝2.291，95%CI：1.094～4.800，P＝0.028）和2.532 倍（OR＝2.532，95%CI：1.235～5.192，P＝0.011）。見表1。

2.3 廣西壯族T2DM 患者與健康對照人群的一般臨床資料比較 如表2 分析結果顯示，相比于健康人對照組，T2DM 組的男性頻率、中位年齡及血漿FPD、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平升高，而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平下降，差異具有統計學意義（P均＜0.05）；血漿Cr、TC、LDL-C 水平在T2DM 組中雖呈升高趨勢，但兩組間差異無統計學意義（P均＞0.05）。

表2 廣西壯族T2DM 患者和健康對照人群的一般臨床資料比較

2.4 廣西壯族人群同種rs2241766T／G 基因型的代謝指標比較 相比于健康人對照組GG 基因型，T2DM 組GG 基因型的FPG、AⅡ、REN、GH、Cor 水平升高，ACTH、ALD、IGF-1 水平下降，差異具有統計學意義（P均＜0.05）。FPG、Urea、TG、TC、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平在兩組TG 型間的差異仍具統計學意義（P均＜0.05），且在T2DM 組呈現高水平狀態；而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 則呈低水平趨勢（P均＜0.05）。T2DM 組TT 型的FPG、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平明顯高于健康人對照組，但其HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平則相反（P均＜0.05）。見表3～5。

表3 T2DM 患者與健康對照人群GG 基因型的臨床代謝指標比較

表4 T2DM 患者與健康對照人群TG 基因型的臨床代謝指標比較

表5 T2DM 患者與健康對照人群TT 基因型的臨床代謝指標比較

2.5ADIPOQrs2241766T／G 多態性對T2DM 代謝指標的影響 T2DM 患者的FPG、Urea、TG、TC、HDL-C、LDL-C、CRP、ACTH、AⅡ、ALD、REN、GH、IGF-1、Cor 水平均不受rs2241766T／G SNP 顯著影響，各基因型間差異無統計學意義（P均＞0.05），但三組不同基因型患者的Cr 水平差異有統計學意義（P＝0.049），rs2241766T／G SNP 可影響廣西壯族T2DM 患者的Cr 代謝水平。見表6。

表6 不同rs2241766T／G 基因型T2DM 患者的臨床代謝指標比較

3 討論

T2DM 是一種常見的慢性進行性代謝疾病，常導致機體各種代謝參數出現異常［7-9］。本研究發現T2DM 患者的FPD、Urea、TG、CRP、AⅡ、REN、GH、Cor 水平高于健康對照人群；而HDL-C、ACTH、ALD、IGF-1 水平低于健康人對照人群，符合T2DM的代謝特征［10］。

ADIPOQ作為糖尿病腎病候選基因［11］，被證實與代謝綜合征及T2DM 易感性相關［4，12-14］。其中，rs2241766 SNP 在不同人群中被廣泛報道。本研究結果發現，TG、TT 基因型及TG+TT 基因型均與T2DM 易感性增加顯著相關。在調整性別和年齡共同風險因素后，此相關性仍顯著；TG、TT、TG+TT基因型患T2DM 的風險分別是GG 基因型的2.863、2.291 和2.532 倍，表 明rs2241766G／T SNP 為T2DM 風險因素，且TG 和TT 基因型可能是T2DM易感基因型，而GG 基因型可能對其有保護作用。此相關性與以往不同人群中的研究結果呈現一致性［3，15-17］，但仍與部分報道結果相悖，例如Han等［18］研究表明此多態性與T2DM 不相關。本研究還發現，無論是T 等位基因還是G 等位基因均與廣西壯族人群T2DM 風險不相關，不構成其易感因素。但近期針對中國臺灣人群的研究表明，攜帶G等位基因的中國臺灣個體發生T2DM 風險比攜帶T等位基因人群高0.82 倍［2］；Dong 等［5］的一項薈萃分析結果表明，rs2241766 T 等位基因增加了西亞人群T2DM 風險，而相同等位基因卻降低了南亞人群的T2DM 風險。綜上所述，地區差異、人群不同及群體遺傳多樣性可能是造成上述結果差異的潛在原因。本研究針對的是廣西壯族人群，雖與中國臺灣人群同屬中國個體，但極大可能存在種族遺傳差異性，導致所得結果相矛盾。T2DM 的發生本是一個復雜的過程，受不同基因、不同SNP 及環境因素等共同影響，本研究中調整因素較少，其他外源混雜因素可能對研究結果有潛在影響。以往報道rs2241766G／T SNP 與糖尿病多種代謝參數相關［19-21］，但本研究僅發現Cr 水平受此多態性影響，并且影響結果位于統計學臨界值（P＝0.049），分析原因可能本研究樣本量有限和樣本選擇偏倚降低了研究結果的權威性，后續將進一步擴大樣本量，排除更多混雜因素進行更精確分析。

本研究評估ADIPOQrs2241766G／T SNP 與廣西壯族T2DM 易感性間的相關性，豐富了ADIPOQSNPs 在人類群體遺傳學方面的研究。但本研究仍存在局限之處，包括研究對象來源單一、未排除基因—環境相互作用的影響、樣本量不足及排除混雜因素少等。后續的ADIPOQSNP 研究將進一步加大樣本量及擴寬研究對象納入范圍。綜上所述，ADIPOQrs2241766G／T 多態性與廣西壯族T2DM易感性增加顯著相關，可能是預測T2DM 風險的潛在遺傳標志物；對攜帶TG 和TT 基因型的個體進行早期干預可能是預防和延緩T2DM 發生和進展的有效手段。