蠟蚧輪枝菌及其在有害生物防治中的應用研究進展

張鵬飛,張昕然,張 龍

(1. 邢臺學院,河北省“邢棗仁”利用技術創新中心,河北邢臺 054000; 2. 北京嘉景生物科技有限公司,北京100193; 3. 山東省農業科學院植物保護研究所,濟南 250100)

病蟲害的化學防治引起了食品安全、環境污染等一系列問題,生物防治受到越來越多的重視。蠟蚧輪枝菌Lecanicilliumspp.是一類重要的有害生物生防真菌,其寄主范圍極其廣泛,除可以寄生半翅目、鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、雙翅目等昆蟲外,還可寄生螨類、線蟲以及引起銹病、白粉病、綠霉病的病原真菌等(詳見附錄增強出版材料)。最早在1861年,Nietner報道了一種寄生錫蘭咖啡蠟蚧Lecaniicoffeae的真菌;1898年,Zimmermann將其命名為蠟蚧頭孢霉CephalosporiumlecaniiZimm;1939年,Viegas將其并入輪枝孢屬VerticilliumNees(Zare and Gams, 2001);2001年,Zare和Gams將該屬中對節肢動物、線蟲、真菌具有致病性的種類放在新建立的蠟蚧輪枝菌屬LecanicilliumW. Gams &Zare中(Zareetal., 2000; Gams and Zare, 2001)。目前,國際菌物系統分類網站(http://www.indexfungorum.org)中共收錄蠟蚧輪枝菌屬真菌30余種,其中包括研究較多的漸狹蠟蚧菌Lecanicilliumattenuatum、蠟蚧輪枝菌L.lecanii、長孢蠟蚧菌L.longisporum、絲枝蠟蚧菌L.aphanocladii、毒蠅蠟蚧菌L.muscarium、刀孢蠟蚧菌L.psalliotae、蛀蟲蠟蚧菌L.cauligalbarum等,而這些種類的蠟蚧輪枝菌在之前被統稱為蠟蚧輪枝菌V.lecanii?？茖W家已經通過自然篩選、遺傳改造、基因工程改造等手段獲得了許多優良的菌株,并將這些菌株開發成防治粉虱、薊馬、蚜蟲和害螨的10余種生物農藥(Faria and Wraight, 2007)。蠟蚧輪枝菌分泌的各種降解酶和毒素在作用靶標的過程中也發揮著非常重要的作用,科學家在此領域也開展了許多研究,試圖研發新的農藥。此外,蠟蚧輪枝菌還可與其他化學農藥、昆蟲天敵等產品協調應用,從而更有效的防治病蟲害?？傊?自1861年Nietner報道了蠟蚧輪枝菌后,科學家對其開展了大量的研究,主要集中在致病性、致病機理等方面。盡管已有一些關于蠟蚧輪枝菌研究進展的綜述(陳吉棣, 1985; Vinod, 2014),尚罕見對于該菌的致病性進行深入全面總結。本文對蠟蚧輪枝菌的致病性、致病機理、與化學農藥的相容性,以及菌株基因工程改良4個方面進行較為全面的綜述,希望能夠為廣大植物保護工作者研究與利用蠟蚧輪枝菌,開展綠色防控提供幫助。

1 蠟蚧輪枝菌致病性

經不完全統計,蠟蚧輪枝菌可以寄生的節肢動物種類至少達46種,其中半翅目21種、雙翅目7種、纓翅目4種、鱗翅目4種、鞘翅目2種、直翅目3種、膜翅目2種、螨類3種。有關蠟蚧輪枝菌對蚜蟲、蚧殼蟲、粉虱、薊馬、害螨等農林生產中重要的小型刺吸式害蟲的致病性研究最多,已報道種類至少27種,其中又數蚜蟲的種類最多,達10余種,其次為蚧殼蟲、粉虱Aleyrodidae、薊馬和害螨。例如,長孢蠟蚧菌和蠟蚧輪枝菌均對柑橘粉蚧具有致病性,都可用于溫室柑橘粉蚧的防控,而且對若蟲的防效較成蟲更好。目前,開發出的蠟蚧輪枝菌商品化制劑也主要針對的是這些小型刺吸式害蟲,例如,防治蚜蟲的長孢蠟蚧菌農藥“Vertalec?”;防治粉虱、蚜蟲和害螨的“Verticillin?”;防治粉虱和薊馬的毒蠅蠟蚧菌生物農藥“Mycotal?”;防治粉虱和薊馬的“Vertirril?”等(Faria and Wraight, 2007)。這些產品在農業生產中發揮著重要作用。蠟蚧輪枝菌對家蠅Muscadomestica、瓜實蠅Bactroceracucurbitae、棕尾麻別蠅Boettcheriscaperegrina等至少7種蠅類具有致病性。據報道,蠟蚧輪枝菌對橄欖實蠅Bactroceraoleae的致病力高于金龜子綠僵菌Metarhiziumanisopilae和球孢白僵菌Beauveriabassiana(Mahmoud, 2009)。蠟蚧輪枝菌可在畜牧場中叮咬牛羊的廄螫蠅Stomoxyscalcitrans種群中流行(Skovgrd and Steenberg, 2002)。據報道,蠟蚧輪枝菌對茶樹害蟲假眼小綠葉蟬Empoascavitis和茶小綠葉蟬E.flavescens、蔬菜害蟲菜青蟲Pierisrapae、小菜蛾Plutellaxylostella、水稻害蟲水稻二化螟Chilosuppressalis、世界性儲煙害蟲煙草粉斑螟Ephestiaelutella、糧倉重要害蟲赤擬谷盜Triboliumcastaneum以及食用菌重要害蟲平菇厲眼蕈蚊Lycoriellapleuroti的蛹和幼蟲都具有致病性?；认x災害是我國古代三大自然災害之一,至今依然對全世界的農業生產造成嚴重危害。Johnson等人通過室內及田間罩籠的方式評價了蠟蚧輪枝菌對雙線黑蝗Melanoplusbivittatus、雙帶黑蝗M.packardii和血黑蝗M.sanguinipes的致病力,結果顯示蠟蚧輪枝菌對這3種黑蝗有防效。有些蠟蚧輪枝菌菌株對天敵昆蟲槳角蚜小蜂Eretmocerussp.以及茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebustestaceipes也有致病性。槳角蚜小蜂在煙粉虱Bemisiatabaci若蟲體內產卵6 d后施用毒蠅蠟蚧輪枝菌,致死率隨施用孢子濃度的增加而增加,而在產卵12 d后施用蠟蚧輪枝菌,致死率不受影響。蠟蚧輪枝菌在防治褐色橘蚜Toxopteracitricida的同時對其天敵昆蟲茶足柄瘤蚜繭蜂的存活也有較重影響。應用濃度為1.49×109個孢子/mL蠟蚧輪枝菌孢子侵染褐色橘蚜12 d后的致死率為78.9%,而用濃度為1.95×109個孢子/mL蠟蚧輪枝菌孢子作用茶足柄瘤蚜繭蜂6 d后的致死率卻達到了95.1%。狄斯瓦螨Varroadestructor不僅直接吸食蜜蜂成蟲和幼蟲的血淋巴,而且可以傳播蜜蜂病毒病,是養蜂業中的一種重要害蟲。研究表明,濃度為1×108個孢子/mL蠟蚧輪枝菌孢子作用狄斯瓦螨7 d后,致死率可達100%。二斑葉螨Tetranychusurticae是農業生產中的一種重要害螨,有室內生物測定結果表明蠟蚧輪枝菌對二斑葉螨具有致病力,但溫室防治試驗顯示該蠟蚧輪枝菌的防效不高。蠟蚧輪枝菌除了寄生上述節肢動物外,對根結線蟲和孢囊線蟲均有致病性,刀孢輪枝菌Lecanicilliumpsalliotae分泌的絲氨酸蛋白酶可以降解腐生性的全齒復活線蟲Panagrellusredivivus的體壁(Yangetal., 2007)。線蟲的卵、幼蟲和雌蟲是蠟蚧輪枝菌的主要靶標蟲態,尤其是卵。刀孢蠟蚧菌對線蟲不同時期的卵均有侵染能力,但對處于胚前發育期卵的寄生率明顯處于高于胚后發育期的(曹君正等, 2012)。線蟲的卵殼從外向內依次為卵黃層、幾丁質層和脂質層,其中幾丁質層最厚,也最堅固,是防御病原物入侵的重要屏障,蠟蚧輪枝菌分泌的幾丁質酶在其穿透線蟲卵殼,尤其是幾丁質層的過程中具有重要作用(Burgwynetal., 2003)。蠟蚧輪枝菌還可以重寄生引起植物病害的病原真菌。蠟蚧輪枝菌(商品名:Mycotal)可有效抑制溫室葫蘆上的白粉病,并且發現,助劑礦物油對防治效果有重要影響。蠟蚧輪枝菌對盆栽非洲菊白粉病也有良好的防效,而且過低或過高的孢子濃度均可使防效降低,濃度過低導致致病力不夠,而濃度過高又可能對非洲菊的生長產生不良影響(詳見附錄增強出版材料)。與作用昆蟲類似,濕度對于蠟蚧輪枝菌控制真菌病害有重要的影響,在蠟蚧輪枝菌侵染黃瓜白粉病致病真菌單絲殼菌Sphaerothecafuliginea的試驗中就觀察到了這一現象(Verhaaretal., 1998)。另一項研究表明,在相對濕度95%～100%的條件下,蠟蚧輪枝菌孢子可以成功重寄生引起小麥條銹病的條形柄繡菌Pucciniastriiformis,而當濕度降至85%時,未能觀察到任何侵染跡象(Mendgen, 2010)。由此可見,濕度往往是一個重要的限制條件,篩選適應干燥環境的菌株非常有必要。

2 蠟蚧輪枝菌致病機理

蠟蚧輪枝菌對節肢動物的致病過程主要包括分生孢子在寄主體壁附著、萌發并形成侵入釘、菌絲穿透體壁、在血腔形成芽生孢子并萌發形成營養菌絲、菌絲入侵細胞及器官等環節。研究表明,日本龜蠟蚧Ceroplastesjaponicus的口器、足的邊緣、肛門及氣門周圍是最易被蠟蚧輪枝菌孢子入侵的部位。日本龜蠟蚧感染蠟蚧輪枝菌24 h后,孢子成功附著到體壁上,48 h后萌發的菌絲形成侵入釘,72 h后侵入釘穿透體壁進入血腔并形成芽生孢子,92 h后芽生孢子擴散到整個血淋巴中,嚴重破壞血細胞的同時,對氣管、馬氏管、肌肉組織等器官也產生嚴重破壞,144 h后日本龜蠟蚧死亡(Liuetal., 2009)。蠟蚧輪枝菌孢子在菜青蟲各齡幼蟲體壁上的萌發時間一致,均為12 h,但侵入釘穿透體壁的時間在不同齡期幼蟲間存在差異。對于2～3齡的菜青蟲幼蟲,24 h后即可穿透體壁,而對于4～5齡的幼蟲的時間為36 h。侵入蟲體的菌絲首先在血腔中生長,然后侵入脂肪體和肌肉,之后中腸、馬氏管、絲腺等相繼被侵入,最終出現體壁分離、脂肪體變形、溶解、肌纖維排列松散等癥狀而死亡(Zhangetal., 2003)。龐仁乙等人發現,蠟蚧輪枝菌分生孢子在不同蟲態的絲光綠蠅Luciliasericata體表上的附著數量存有顯著差異。由于成蟲體壁密集著剛毛、鬃等體壁外長物,導致成蟲附著的孢子明顯多于蛹和幼蟲,附著數量可能對致病力具有一定的影響(Pangetal., 2015)。值得關注的是,并非所有蠟蚧輪枝菌都通過穿透體壁侵染。長孢蠟蚧菌孢子在豌豆蚜和柑橘粉蚧體表萌發后,菌絲布滿整個蟲體,菌絲利用表皮水解產物獲取營養,使寄主死亡變僵后,又長出新的分生孢子,整個過程菌絲未穿透體壁(Ghaffarietal., 2017; Zhangetal., 2020。蠟蚧輪枝菌對引起病害的致病真菌的致病過程大致也分為孢子附著、在機械壓力和降解酶的共同作用下穿透寄主細胞、在寄主細胞內生長使其崩解等步驟。對引起黃瓜白粉病的單絲殼菌Sphaerothecafuliginea致病機理研究表明,蠟蚧輪枝菌首先通過分泌粘液,使孢子緊緊附著到寄主菌絲上,24 h后可明顯觀察到寄主細胞發生空泡化以及解體現象,36 h后細胞膜收縮,細胞質聚集,48 h后,細胞壁嚴重變形扭曲,細胞嚴重解體,72 h后,寄主細胞徹底崩解,細胞質被消耗殆盡,周圍空間被蠟蚧輪枝菌占據(Askaryetal., 1997)。蠟蚧輪枝菌侵染線蟲卵的機理大致與上述侵染昆蟲和病原真菌類似。首先菌絲吸附到線蟲卵殼上形成附著胞和侵染釘,之后侵染釘通過機械壓力以及分泌降解酶的共同作用穿透卵殼,最終導致卵因失水而喪失活性(Moosavietal., 2011)。

圖1 蠟蚧輪枝菌對日本龜蠟蚧Ceroplastes japonicus和溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorum的致病性以及對柑橘綠霉病的抑制作用Fig.1 Pathogenicity of Lecanicillium against Ceroplastes japonicus and Trialeurodes vaporariorumand its inhibitory effect against green mold of citrus注:A,感染蠟蚧輪枝菌的日本龜蠟蚧體表長出了白色的菌絲(Liu et al., 2009);B,感染蠟蚧輪枝菌的溫室白粉虱體表長出了白色的菌絲;C～D,蠟蚧輪枝菌對引起柑橘綠霉病的指狀青霉菌Penicillium digitatum的抑制作用(Benhamou, 2004)。圖C為單接種指狀青霉菌的對照,柑橘果實表面長滿了指狀青霉菌的白色菌絲,其中上半部分的白色菌絲長滿了灰綠色的孢子(箭頭所示),呈現出綠霉病的典型癥狀;圖D為共同接種指狀青霉菌和蠟蚧輪枝菌的果實,由于指狀青霉菌受到蠟蚧輪枝菌的抑制,只在接種處的局部區域長出了指狀青霉菌白色菌絲。Note: A, Ceroplastes japonicus died from Lecanicillium spp. showing white hyphal growth (Liu et al., 2009); B, Trialeurodes vaporariorum died from Lecanicillium spp. showing white hyphal growth; C～D, Inhibitory effect of Lecanicillium spp. against Penicillium digitatum which caused green mold of citrus (Benhamou, 2004). The citrus inoculated only with P.digitatum was covered with white hyphal (the bottom half) and grey-green spores (the top half), showing typical symptoms of green mold(C). White hyphal of P.digitatum only grew from inoculation area of citrus inoculated with both of P.digitatum and Lecanicillium spp., showing the inhibitory effect of Lecanicillium spp. against P.digitatum (D).

致病真菌分泌的降解酶在其侵入寄主體壁的過程中發揮了重要作用?，F已明確昆蟲致病真菌、線蟲致病真菌和植物病原菌的重寄生真菌分泌的幾丁質酶是一類非常重要的降解酶(Kobayashietal., 2002; Charnley, 2003)。幾丁質是一類具有長鏈β-1, 4-N-乙酰葡萄糖胺的高分子生物多聚體,存在于昆蟲體壁、線蟲卵殼以及植物病原真菌的細胞壁中(Bartnicki-Garcia, 1968; Wharton, 1980; Merzendorfer and Zimoch, 2013)。幾丁質酶可催化水解幾丁質的β-1,4糖苷鍵生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)(Shaikh and Deshpande, 1993),是降解幾丁質的關鍵酶類。有關蠟蚧輪枝菌幾丁質酶的研究也有一些報道。例如,番茄經白粉虱刺激后所產生的揮發物可以促進蠟蚧輪枝菌幾丁質酶基因的表達,從而提高了蠟蚧輪枝菌對白粉虱的毒性(Linetal., 2021);從蠟蚧輪枝菌中分離純化的幾丁質酶對植物病原菌串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme的孢子萌發具有抑制作用(Gangetal., 2015);從漸狹蠟蚧菌中分離純化的幾丁質酶對南方根結線蟲Meloidogyneincognita的卵具有破壞作用(Nguyenetal., 2007);從刀孢輪枝菌克隆到的幾丁質酶基因Lpchil,經畢赤酵母PichiapastorisGS115系統表達得到的幾丁質酶可以降解南方根結線蟲的卵殼,同時對卵的發育具有抑制作用(Ganetal., 2007)。還有研究表明,不同的培養基成分對蠟蚧輪枝菌降解酶的活性具有重要影響。余德億等人研究表明,與明膠、幾丁質等成分相比,在培養基中添加榕母管薊馬Gynaikothripsflcorum、菜縊管蚜Lipaphiserysimi和煙粉虱的蟲尸粉可以顯著提高蠟蚧輪枝菌降解酶的活性,同時顯著提高了菌株對榕母管薊馬若蟲和成蟲的毒力(余德億等, 2016)。還有研究表明,在蠟蚧輪枝菌培養基中添加蟬蛻和煙粉虱的蟲尸粉連續培養5代后,與常規培養基相比,蠟蚧輪枝菌的降解酶活性以及對煙粉虱的毒力均顯著提高(景亮亮等, 2020)。

昆蟲致病真菌一般存在毒力弱、不易儲藏、對田間環境適應性差等問題,使其廣泛應用受到了限制。然而,昆蟲致病真菌在侵入蟲體后分泌的毒素往往比較穩定,是一類很有潛力的天然殺蟲產物?？蒲腥藛T先后從綠僵菌、白僵菌、萊氏野村菌Nomuraea、曲霉Aspergillus、擬青霉Paecilomyces、輪枝菌、多毛菌Pestalotiopsis等屬的真菌菌絲及培養基中分離出破壞素(Destruxin)、白僵菌素(Beauvercin)等一系列毒素(蒲蟄龍和李增智, 1996)。自1978年日本學者Kanaoka首次報道了一類對家蠶具有毒殺作用的環狀縮羧肽類蠟蚧輪枝菌毒素后,許多研究報道蠟蚧輪枝菌可以產生毒素(Kanaokaetal., 1978)?，F已證實,蠟蚧輪枝菌粗提液對各個蟲態的煙粉虱、白粉虱、桃蚜、菜粉蝶Pierisrapae5齡幼蟲、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、葉蟬Empoascakerri、大豆胞囊線蟲Heteroderaglycines等多種害蟲均具有毒力(Gindinetal., 1994; 王克勤等, 2000; 宋肖玲和李國霞, 2005; Sharma and Vyas, 2008; Shinyaetal., 2008; 紀明山等, 2010; Wangetal., 2010; 洪慧金等, 2011)。此外還發現,蠟蚧輪枝菌粗提液對天敵昆蟲小黑瓢蟲Delphastuscatalinae的幼蟲也具有毒力,需要在開發過程中注意對天敵的殺傷作用(Wangetal., 2005)。目前已經明確的蠟蚧輪枝菌毒素主要包括啶羧酸類、環狀縮羧肽類、磷脂酸類似物以及蛋白類共4類。Claydo等人從蠟蚧輪枝菌次生代謝產物中提取出一類對麗蠅Calliphoraerythrocephala具有殺蟲活性的吡啶二羧酸物質(Claydon and Grove, 1982);Wang等人報道了一種對煙粉虱具有較強毒性的環狀縮羧肽類蠟蚧輪枝菌毒素(Wangetal., 2010);Soman等人從蠟蚧輪枝菌代謝產物中分離出了一種對棉鈴蟲具有殺蟲活性的磷脂酸類似物(Somanetal., 2001)。有關蠟蚧輪枝菌蛋白類毒素有一些相對較為深入的研究。Abdul等人用從蠟蚧輪枝菌代謝物中提取的蛋白處理番茄后再飼喂桃蚜,發現桃蚜的存活率及繁殖力均受到較明顯的抑制。進一步研究發現,番茄經此毒蛋白處理后,其抗蟲基因的表達水平明顯上調,而且這些上調的基因均為植物典型的水楊酸抗蟲途徑和茉莉酸抗蟲途徑中的關鍵基因(Abduletal., 2020)。

3 蠟蚧輪枝菌與農藥的相容性及協調應用

協調應用化學農藥與昆蟲病原真菌防治病蟲害可減少化學農藥的施藥次數及用量(Pamela, 2019)。由于化學農藥對昆蟲病原真菌的生長具有不同程度的抑制作用,因此,明確二者的相容性是復配應用的必要前提(Sainetal., 2019)。自從英國的Hall在20世紀80年代測試了20種農藥與蠟蚧輪枝菌的相容性后,科學家在該領域開展了大量研究(Hall, 1981)。大部分化學農藥都對蠟蚧輪枝菌具有不同程度的抑制作用。與殺蟲劑相比,作為真菌的蠟蚧輪枝菌與殺菌劑的相容性更差。一些特殊類型的農藥有時與蠟蚧輪枝菌可以很好的相容。研究發現,丙環唑、代森錳鋅等6種殺菌劑以及吡蟲啉、噻嗪酮等4種殺蟲劑對蠟蚧輪枝菌的抑制作用均很強(Cuthbertsonetal., 2005; Alietal., 2012),而防治番茄灰霉病的一種微座孢屬真菌以及防治白粉病的一種植物提取物與蠟蚧輪枝菌具有很好的相容性(Bardinetal., 2008)。蠟蚧輪枝菌與防治煙粉虱的一種海藻酸(商品名:Agri-50E)和一種螺甲螨酯(商品名:Oberon)的相容性很好,而與防治煙粉虱的一種植物提取物(商品名:Majestik)、礦物油以及一種脂肪酸的相容性卻較差(Cuthbertsonetal., 2008)。相容性不僅受化學農藥種類的影響,而且與助劑、菌株也有較大關系(Andersonetal., 1989)。在翟曉曼等人的研究中,吡蟲啉對蠟蚧輪枝菌孢子萌發的抑制率高于谷祖敏等人的結果,可能原因在于與普通吡蟲啉制劑相比,翟曉曼等人所用的高滲吡蟲啉制劑含有高滲助劑,有助于農藥滲入真菌體內而使抑制作用增強(谷祖敏等, 2006; 翟曉曼等, 2013)。

值得注意的是,在實際生產應用時,可以采用先噴施化學農藥再噴施蠟蚧輪枝菌的這一間接的方式復配,往往即不影響協調應用的效果,又可以解決相容性問題。上述與蠟蚧輪枝菌相容性很差的吡蟲啉、噻嗪酮、礦物油等,與蠟蚧輪枝菌采用先后噴施的協調應用方式成功解決了相容與復配之間的矛盾(Cuthbertsonetal., 2005; Cuthbertsonetal., 2008)。針對這一現象的機理也有一些研究。研究發現,用吡蟲啉農藥處理過的榕管薊馬Gynaikothripsuzeli對蠟蚧輪枝菌的抗性減弱,使得后續噴施的蠟蚧輪枝菌的效果增強,這主要由于經吡蟲啉處理的榕管薊馬對蠟蚧輪枝菌的酚氧化酶途徑相關的免疫能力下降所致(Linetal., 2018)。蠟蚧輪枝菌還是部分植物的內生真菌,部分植物內寄生蠟蚧輪枝菌后對蚜蟲的抗性增強,這種增強的抗性可能直接來自蠟蚧輪枝菌,也可能來自菌與植物間互作產生的代謝物(Andersonetal., 2007)。研究表明,當用接種了蠟蚧輪枝菌的棉花葉片飼喂棉蚜AphisgossypiiGlover,棉蚜的繁殖力明顯下降(Gurulingappaetal., 2010)。蠟蚧輪枝菌與部分植物間的內寄生關系,為其與化學農藥的復配提供了新的思路。研究表明,當用噻蟲嗪、丁醚脲、硫丹等9種農藥與蠟蚧輪枝菌直接復配,均產生了不同程度的抑制作用,硫丹甚至產生了完全的抑制作用,但當先用蠟蚧輪枝菌寄生棉花,再向棉花噴施這 9種農藥,未發現任何抑制作用(Gurulingappaetal., 2011)。

有關蠟蚧輪枝菌與生物農藥的協調應用也有一些報道。研究表明,蠟蚧輪枝菌與印楝素、苦參堿混配防治大豆蚜Aphisglycines均具有明顯的協同增效作用,其中與印楝素混配增效更明顯,處理7 d后的田間防效可達89.47%(莽逸倫等, 2006)。植物源殺蟲劑椰樹皂(商品名:Palizin)、胡椒提取物(商品名:Tondexir)以及蠟蚧輪枝菌均可用于防治危害蜜蜂的大蠟螟Galleriamellonella。據報道,先用亞致死劑量的Palizin或Tondexir作用大蠟螟24 h,再施用蠟蚧輪枝菌孢子懸浮液,發現Palizin處理過的大蠟螟對蠟蚧輪枝菌的敏感性受到了抑制,而Tondexir作用過的大蠟螟不受影響(Faribaetal., 2019)。微座孢屬生防真菌Microdochiumdimerum、一種虎杖Reynoutriasachalinensis提取物(商品名:Milsana)和蠟蚧輪枝菌(商品名:Mycotal)可分別用于控制溫室番茄的三大病蟲害:灰霉病、白粉病和粉虱。為了實現對這3種病蟲害的統防統治,對這3種制劑的聯合防效進行了評價,結果顯示,混合應用對各制劑的防效無抑制作用,互不影響,可以混用進行統防統治(Bardinetal., 2008)。適宜的助劑亦可增加蠟蚧輪枝菌的藥效。納米緩釋劑可通過延長農藥的持效期、提高農藥的分散性和滲透性等增強藥效。據報道,蠟蚧輪枝菌與納米網構控失劑SC108、納米活性炭混合使用可顯著提高其對桃蚜和西花薊馬的防效,但對煙粉虱的增效作用不明顯(張紅艷等, 2020)。有關蠟蚧輪枝菌與天敵昆蟲的協調應用也有一些報道。將攜帶蠟蚧輪枝菌孢子的一種小花蝽屬的捕食性天敵Oriuslaevigatus釋放到青椒上防治桃蚜,5 d后98%的桃蚜感染了蠟蚧輪枝菌,防治效果顯著高于單釋放小花蝽以及單噴施蠟蚧輪枝菌(Downetal., 2009)。鄭珊珊等人聯合施用蠟蚧輪枝菌孢子懸液和天敵昆蟲纓小蜂Schizophragmaparvulas防治假眼小綠葉蟬的效果顯著好于單獨施用這兩種生物農藥(鄭珊珊等, 2012)。相反,有的蠟蚧輪枝菌對天敵昆蟲,如茶足柄瘤蚜繭蜂和槳角蚜小蜂具有殺傷作用。與噴施了蠟蚧輪枝菌的溫室白粉虱若蟲相比,天敵昆蟲麗蚜小蜂Encarsiaformosa更青睞寄生噴施了吐溫-80的對照溫室白粉虱若蟲(Fazeli-Dinanetal., 2016)。Aqueel等人發現,先用蠟蚧輪枝菌感染小麥上的禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi和麥長管蚜Sitobionavenae,并不影響蚜繭蜂Aphidiuscolemani對這兩種蚜蟲的寄生,然而,先用蚜繭蜂寄生這兩種蚜蟲后再用蠟蚧輪枝菌感染,發現蚜繭蜂寄生過的這兩種蚜蟲的蠟蚧輪枝菌感染率顯著低于未寄生過的對照蚜蟲。Aqueel等人還證實了異色瓢蟲Harmoniaaxyridis也存在上述現象。異色瓢蟲取食被蠟蚧輪枝菌感染了72 h的上述兩種蚜蟲的數量顯著低于取食未經感染的對照蚜蟲(Aqueel and Leather, 2013)。

4 菌株的基因工程改良

蠟蚧輪枝菌的基因工程改造主要包括原生質體融合、誘變和轉基因3種方式。真菌的原生質體融合技術是指把兩個具備不同優良性狀的親本菌株利用酶解法去除細胞壁獲得僅由細胞膜包裹的球狀原生質體,然后采用物理方法(如電融合)、化學方法(如聚乙二醇)或生物方法(如病毒)使細胞相互接觸,逐步發生膜融合、胞質融合以及核融合,進而發生基因重組,在適當的條件下融合子再生即獲得雜交菌株。Aiuchi等人將數十種蠟蚧輪枝菌進行原生質體融合,最終篩選出13株既耐干旱,同時又對棉蚜和粉虱具有高致病力的雜合菌株(Aiuchietal., 2007)。Shinya等人利用原生質體融合技術針對大豆孢囊線蟲Heteroderaglycines篩選優良菌株,發現由毒蠅蠟蚧菌與長孢蠟蚧菌融合的AaF42菌株對線蟲卵的致死率高出空白對照93%,同時還發現,AaF42融合菌株培養基濾液對線蟲的卵和2齡幼蟲都具有明顯的抑制作用(Shinyaetal., 2008a; 2008b)。Xie等人研究了通過紫外誘變和化學誘變改變蠟蚧輪枝菌對殺菌劑霜霉威的抗性問題。紫外誘變結果表明,經過6輪誘變,菌落高度變矮,但產孢量以及對蚜蟲的致病性未受影響,但對霜霉威產生了明顯的抗性(Xieetal., 2018);化學誘變結果表明漸狹蠟蚧菌經N-甲基-N"-硝基-N-亞硝基胍誘導發生突變后對霜霉威的抗性最高提高了2.79倍,產孢量、菌落的生長情況以及對線蟲卵的致病力均無顯著變化(Xieetal., 2016)。通過轉基因的方式可以將優良基因直接轉入目標菌株。Zhang等人利用聚乙二醇介導的原生質體轉化體系將白僵菌的表皮降解蛋白酶基因Cdep1轉入蠟蚧輪枝菌后,新菌株的蛋白酶活性提高了5倍,對棉蚜的致死中濃度(LC50)降低了2倍,致死中時間(LT50)減少了14.2%,在蟲體內的生長速度明顯加快,而在培養基上的產孢量無差異(Zhangetal., 2016)。同樣,Xie等人將白僵菌表皮降解蛋白酶Cdep1基因轉入漸狹蠟蚧菌后,新菌株蛋白酶的活性不僅增加了2～3倍,而且酶活性出現的時間也提前了。進一步研究表明,用這一新改造的漸狹蠟蚧菌培養基濾液處理大豆包囊線蟲,發現對卵的孵化以及2齡幼蟲的活動能力均表現出明顯的抑制作用(Xieetal., 2016)?？茖W家還將東亞鉗蝎Buthusmartensi的蝎毒素基因BmKit轉入蠟蚧輪枝菌中,獲得的新菌株比野生型菌株對棉蚜的致死中濃度降低了7.1倍,致死中時間減少了26.5%(Zhaoetal., 2015)。毒蠅蠟蚧菌轉入漏斗網蛛毒素基因后,可以成功分泌重組蛋白,但對寄主的致病力是否提高尚未研究(Sergeyetal., 2019)?？蒲腥藛T還借助RNA干擾技術成功獲得了一株高效蠟蚧輪枝菌菌株,首先針對寄主柑橘粉虱Dialeurodescitri(Ashmead)免疫系統的溶菌酶基因(DcLZM)、酚氧化酶原免疫基因(DcPPO)以及酚氧化酶原激活因子基因(DcPPO-AF)3個重要的免疫基因設計雙鏈RNA(dsRNA),并構建dsRNA表達載體,然后轉入漸狹蠟蚧菌中進行表達,使得侵入柑橘粉虱的漸狹蠟蚧菌表達dsRNA,致使柑橘粉虱的上述免疫基因發生沉默,免疫力下降,進而增加了漸狹蠟蚧菌的致病力。最終的生測結果顯示,轉基因菌株的致病力是野生型對照的3倍(Yuetal., 2018)。

5 問題與展望

蠟蚧輪枝菌寄主譜相當廣,既可以侵染害蟲又可以防治植物病害,這為進一步深入研究開發出病蟲兼治的微生物農藥奠定了基礎。然而,盡管已有很多關于蠟蚧輪枝菌的研究報道,但是只有極少菌種(株)被開發出了能夠大規模應用的商品。研究表明,難以大規模生產分生孢子的生物學特性、致病力弱和對環境抗逆性差是重要的限制因素。因此今后還需要從上述幾個方面開展深入研究,以便開發出更多防治效果更好的微生物農藥。利用基因工程技術為開發出適于大規模生產蠟蚧輪枝菌分生孢子、提高其致病力和抗逆性方面提供了可能。

實現蠟蚧輪枝菌有毒代謝產物的商品化生產依然具有很大的挑戰性。真菌毒素一般為多種次生代謝產物的混合物,而且每種化合物的合成時間以及在昆蟲致死過程中發揮作用的時間也各不相同。例如研究較為透徹的羅伯茨綠僵菌M.roberts侵入寄主體內后合成的破壞素是一類包括至少16種相類似的化合物的混合物,而且這些破壞素的天然合成時間又不相同,這將給人工合成以及實際應用帶來很大的困難(Wangetal., 2012)。當然也可以通過繁殖真菌來合成毒素,但這些毒素混合物中往往夾雜有其他的成分,規?；姆蛛x和純化也將具有一定的挑戰性(亓蘭達等, 2020)。